发酵工程综合性实验 2青霉素发酵实验

发酵工程综合性实验2：青霉素的发酵

一、目的与要求

1、学习青霉素生产发酵的工艺流程；

2、学习微型发酵罐（5L）的使用；

2、通过实验，以具体的青霉素发酵生产工艺流程为例，学习发酵原理，掌握种子制备、发酵过程控制、与发酵相关参数的检测，掌握效价测定方法；

二、实验原理

1、工艺控制

（1）影响发酵产率的因素

基质浓度在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱的阻遏或抑制, 苯乙酸的

生长抑制）, 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成, 为了避免这一现象, 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法, 即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。这里必须特别注意的是葡萄糖的流加, 因为即使是超出最适浓度范围较小的波动, 都将引起严重的阻遏或限制, 使生物合成速度减慢或停止。目前, 糖浓度的检测尚难在线进行, 故葡萄糖的流加不是依据糖浓度控制, 而是间接根据pH 值、溶氧或C02 释放率予以调节。

（2）温度青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别, 但一般认为应在25 °C 左右。温度过高将明显降低发酵产率, 同时增加葡萄糖的维持消耗, 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说, 最适温度不是一样的, 一般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度, 以利于青霉素的合成。（3）pH 值青霉素发酵的最适pH 值一般认为在 6. 5 左右, 有时也可以略高或略低一些, 但应尽量避免pH 值超过7.0, 因为青霉素在碱性条件下不稳定,

容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中, pH 值的变化是葡萄糖流加速度

高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使pH 值降低；过低的

加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性

化合物而引起pH 值上升。

（4）溶氧对于好氧的青霉素发酵来说, 溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到30% 饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于10% 饱和度时, 则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高, 说明菌丝生长不良或加糖率过低,

造成呼吸强度下降, 同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态平衡点, 而氧消耗与碳能源消耗成正比, 故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的一个参考指标。

（5）菌丝浓度发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传

递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度(取决于维持因数的大小, 维持因数越大,呼吸强度越高) 、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消

耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升, 从而提高临界菌体浓度。

（6）菌丝生长速度用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比, 当比生长速率高于O. 015h-1时, 比生产速率与比生长速率无关 D 因此, 要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率, 必须使比生长速率不低0.015h-1 。这一比生长速率称为临界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说, 维持0.015h斗的临界比生长速率意味着每46h 就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍, 这在实际工业生产中是很难实现的。事实上, 青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多, 却仍然能达到很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶, 抵消了一部分生长, 故虽然表观比生长速率低, 但真比生长速率却要高一些。

（7）菌丝形态在长期的菌株改良中, 青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触, 故一般比生产速率较高；后者则由于发酵液黏度显著降低, 使气-液两相间氧的传递速率大大提高, 从而允许更多的菌丝生长(即临界菌体浓度较高), 发酵罐体积产率甚至高于前者。

在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度, 并避免结球, 是

获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小和松紧, 并尽量减少游离菌丝的含量, 也是充分发挥其生产能力的关键素之一。这种形态的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率密切相关。

3、工艺控制要点

（1）种子质量的控制丝状菌的生产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25 °C 培养7 天, 真空干燥并以这种形式保存备用。生产时它按一定的接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主的种子罐内,26 °C 培养56h 左右, 菌丝浓度达6%-8%, 菌丝形态正常, 按10%-15%的接种量移人含有花生饼粉、葡萄糖为主的二级种子罐内,27°C 培养24h, 菌丝体积10%-12%, 形态正常, 效价在700D/ml左右便可作为发酵种子。球状菌的生产种子是由冷冻管子孢子经混有O. 5% -1. 0 %玉米浆的三角瓶培养原始亲米孢子, 然后再移人罗氏瓶培养生产大米抱子(又称生产米), 亲米和生产米均为25 °C静置培养, 需经常观察生长发育情况在培养到3-4 天, 大米表面长出明显小集落时要振摇均匀, 使菌丝在大米表面能均匀生长, 待10 天左右形成绿色孢子即可收获。亲米成熟接人生产米后也要经过激烈振荡才可放置恒温培养, 生产米的孢子量要求每粒米300万只以上。亲米、生产米子孢子都需保存在 5 °C冰箱内。

工艺要求将新鲜的生产米(指收获后的孢瓶在10天以内使用) 接人含有花生饼粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、饴糖为主的种子罐内,28 °C 培养50-60h当pH 值由6. 0-6. 5 下降至 5.5-5. 0, 菌丝呈菊花团状,平均直径在100- 130μm, 每毫升的球数为6万-8万只, 沉降率在85% 以上, 即可根据发酵罐球数控制在

8000-11000只/ml 范围的要求, 计算移种体积, 然后接入发酵罐, 多余的种子液弃去。球状菌以新鲜孢子为佳, 其生产水平优于真空干燥的孢子，能使青霉素发酵单位的罐批差异减少。

（2）培养基成分的控制