环介导等温核酸扩增技术快速检测食物中的大肠杆菌O157

环介导等温核酸扩增技术快速检测食物中的大肠杆菌O157王丽;徐振波;赵喜红;钟青萍

【摘要】The specificity and sensitivity of a loop-mediated isothermal amplification （LAMP） method was developed and evaluated for rapid detection of the food-borne Escherichia coli O157 strains. Six primers, including outer primers, inner primers and loop primers, were specially designed for recognizing eight distinct sequences on three targets, which were rfbE, stxl and stx2. The detection limits were found to be 100, 100 and 10 fg DNA/tube for rfbE, stxl and stx2, respectively. Application of LAMP assays were performed on 417 food-borne E. coli strains, the sensitivity of LAMP assays for the rfbE, stxl and stx2 was 100% , 95.3% and

96.3% , and the negative predictive value （NPV） was 100%, 96.7% and

97.1% respectively; with a 100% specificity and positive predictive value （PPV） for all three targets. The results showed that the LAMP assay has proven high specificity, sensitivity and easy operation features in the detection of Escherichia coli 0157. It also implied that the assay owned good application prospect in food safety detection.%建立了环介导等温核酸扩增技术（LAMP）检测食源大肠杆菌O157，并对该方法的灵敏度和特异性进行了评价。分别针对大肠杆菌0157三个特异基因frbE，stx1和stx2的8个独立靶区域设计了外引物、内引物和环引物进行LAMP扩增检测，同时将检测结果与PCR方法做比较。研究结果表明，frbE，stx1和stx2基因的LAMP方法检测限分别为100，100和10fgDNA／管，灵敏度是PCR方法的10倍以上；将建立的

环介导等温扩增法用于417株食物分离的大肠杆菌的检测，发现LAMP检测frbE，stx1和st

【期刊名称】《食品与发酵工业》

【年(卷),期】2011(037)005

【总页数】5页(P146-150)

【关键词】环介导等温核酸扩增（LAMP;大肠杆菌O157;快速检测

【作者】王丽;徐振波;赵喜红;钟青萍

【作者单位】华南农业大学食品学院,广东广州510642;华南理工大学轻工与食品

学院,广东广州510640;华南理工大学轻工与食品学院,广东广州510640;华南农业

大学食品学院,广东广州510642

【正文语种】中文

【中图分类】TS207.4

志贺毒素大肠杆菌是一种重要的病原菌，其中大肠杆菌O157:H7是最为人们熟知和研究较多的一种重要血清型。该致病菌传播途径复杂多样，主要经食品传播，被感染者出现腹泻、呕吐、剧烈腹痛、出血性结肠炎溶血性贫血、溶血性尿毒症等临床症状［1］。大肠杆菌O157:H7产生的志贺毒素主要包括志贺毒素1(Stx1)和志贺毒素2(Stx2)，已报道的Stx2变种与Stx1在物理化学、免疫学和分子遗传学方面具有不同的特征。大肠杆菌O157引起的危害受到广泛关注，是我国进出口食

源性产品必检的致病菌之一［1］。

基于国家标准的分离培养、生化及血清学鉴定需要耗费大量的时间，达几天之久。还有一些快速检测方法，比如应用较广泛的酶联免疫技术，其中，免疫磁珠技术

［2－3］和胶体金免疫层析技术［4］具有易操作和快速的特点，但是，检测样品特异性不够高，容易出现误判。PCR技术和实时定量PCR技术在过去几十年里被大量用于病原菌的检测，灵敏度高和特异性较传统方法有较大提高，但是，PCR 方法必须有精密的温度循环装置，且仅限于实验室操作，另外反应过程容易受污染物影响，假阳性较高，从而使其无法满足实地检测的需要［5］。因此，亟需开发建立灵敏、快速的检测技术实现对大肠杆菌O157:H7及其志贺毒素的高效检测。而新型的核酸扩增技术，环介导恒温核酸扩增技术(LAMP技术)就具有诸多优越性［6］。该技术依赖Bst DNA聚合酶在恒温条件下实现靶基因的自循环链置换合成反应，引物能识别基因的6个或8个独立区域，特异性较PCR大大提高，反应原理如图1所示。另外，反应的温度处于恒温条件60～65℃，普通水浴锅就可以满足扩增的需求，节省了检测费用。检测结果可以方便地通过目视判别，大量目标DNA合成的同时伴随有白色的副产物焦磷酸镁沉淀产生。目前，LAMP技术在食品安全检测、疾病诊断及环境安全等方面有成功应用的报道［7－9］。本研究，将以志贺毒素基因为研究对象，建立环介导等温核酸扩增反应实现对大肠杆菌

O157:H7的检测，并对一大批食物分离的样品进行检测，以验证其灵敏度和特异性。研究结果和方法将为其他食源致病细菌的快速检测提供理论基础。

1.1 菌种

34株参考菌株，包括不同菌种种类的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌在本研究中用于检测LAMP方法的灵敏度和特异性，菌株信息及携带基因信息如表1所列。417株食物分离的大肠杆菌菌株，其中154株为大肠杆菌O157菌株，263株为非O157大肠杆菌菌株。这些菌株是2003－2007年从各种不同的食物样品中分得，现保存于中山市质量计量监督检验所临床微生物学实验室。

1.2 引物设计

针对大肠杆菌的特异基因rfbE基因、志贺毒素基因stx1和stx2分别设计引物。