锌指蛋白在丝状真菌纤维素酶基因表达调控中的研究进展_杨帆

76
纤 维 素 科 学 与 技 术
第 22 卷
指是最为丰富的。这些蛋白许多是转录因子，具有识别 DNA 序列的功能。自 1989 年第一个锌指蛋白的结 构被报道以来[6]，以 Zif268 的结构被阐述为起始[7]，越来越多的 DNA 复合体的结构被阐述。这些结构都 是建立在以 C2H2 型锌指模块的框架不变之上的，提供了一个完整理解锌指蛋白如何结合到 DNA 序列 上的依据。这种结合的特异性是由具有在锌指结构指尖上的一套间断残基或在螺旋表面的侧链底座的相互 作用决定的。另外结合的亲和性是由与磷酸骨架和邻近的锌指之间的相互作用决定的[8]。 在 SWISSPROT 数据库中，多达 70%的锌指蛋白序列连接处可潜在形成 C 帽基序，这说明 DNA 诱导 的螺旋帽在锌指蛋白的功能中有很重要的作用。有一种模式认为连接处本身固有的灵活性能使锌指蛋白搜 寻 DNA 上同源的结合位点变得容易，因为一旦遇到正确的 DNA 序列，连接处的结构就能被诱导产生，使 得锌指蛋白得以正确的方向与 DNA 上的大沟正确结合[9]。在体内对连接处序列的修饰对锌指蛋白的功能 具有深远的影响[10]。 许多调控性分化的转录因子是一种锌指依赖型 DNA 结合域，称为 DM (DNA-binding domain)基序。有 通过核磁共振揭示的一个 DM 基序是一种含有两个 Zn2+结合位点 CCHC 和 HCCC 错综复杂的新型锌指和 具有 C 末端的无序尾巴；这两个结合位点使含有两个螺旋的紧密球状区域稳固，C 末端的无序尾巴功能 是在初期起到识别螺旋的作用。当这种基序结合到 DNA 小沟上时，DNA 没有出现急剧弯曲的情况[11]。
2 丝状真菌中参与纤维素酶基因调控的锌指蛋白类型
丝状真菌是自然界中降解木质纤维素的主要微生物类别，多数丝状真菌可产生纤维素降解酶系。纤维 素酶是指一类能水解纤维素中-1,4-葡萄糖苷键的多组分酶系的总称，主要由纤维二糖水解酶（1,4--D -glucan cellobiohydrolase, CBH） 、内切葡聚糖苷酶（1,4--D-glucan-4-glucnohydrolase, EG）和-葡萄糖苷酶 （-glucosidases, BG）组成[12]。过去几十年，尽管人们对这些酶的生化性质、空间三维结构与酶解机制等 都做了较为系统深入的研究[13]，但关于纤维素酶基因表达调控等领域的研究相对较少。目前，已经发现锌 指蛋白在一些丝状真菌纤维素酶基因表达调控中发挥作用，这些真菌主要来自木霉属（Trichoderma） 、曲 霉属（Aspergillus） 、青霉属（Penicillium） 、脉胞霉属（Neurospora）等。在上述调控过程中发挥作用的主 要为 C2H2 型、C4 型和 C6 型锌指蛋白。 2.1 C2H2 型锌指蛋白 在产纤维素酶的主要工业菌种里氏木霉中，Ilmen M 等[14]于 1996 年发现 CRE1 是一种葡萄糖分解代 谢物阻遏蛋白，含有两个 Cys2-His2 锌指结构域，与哈茨木霉、藤仓赤霉、粗糙脉孢菌、构巢曲霉和黑曲霉 的氨基酸序列同源性分别为 90%、75%、61%、55.6%和 54.7%[14-17]，与上述曲霉属 C2H2 型的 CreA、CreB 都具有编码锌指结构及结合 DNA 进行转录抑制的功能， 在绿僵菌中也存在与 CreA 和 CreC 功能相似[15,18]， 功能相似的 CRR1 蛋白，氨基酸序列同源性为 76%[19]；在酿酒酵母中，存在可阻遏碳源代谢的 C2H2 型转 录因子 Mig1，这类因子具有抑制可替代碳源如：麦芽糖、半乳糖和蔗糖等多达 90 种基因的转录，与 Cre1 氨基酸序列上同源性为 71%[20]。 里氏木霉中另一个纤维素酶基因表达调控因子 ACE1，含有三个 Cys2-His2 锌指结构域，该基因的蛋白 氨基酸序列与康氏木霉、绿僵菌、球孢白僵菌的同源性为 97%、73%、59%，在曲霉属、脉胞霉属均存在 序列同源[21-24]。上述结果表明其广泛存在于丝状真菌中。 作为粗糙脉胞菌中 pH 调控蛋白 PacC，能通过特异的激活与碱性相关的基因和抑制与酸性相关的基因 而改变胞外的 pH，间接起到对纤维素酶或木聚糖酶基因的激活调控，所以一般认为它是一个纤维素酶和 木聚糖酶基因转录激活蛋白，含有三个 Cys2-His2 锌指结构域，所结合的序列位点为 5’-GCCARG-3’，该基 因与产黄青霉属、特异青霉菌和白曲霉的蛋白氨基酸序列同源性分别为 98%、95%和 81%[25-28]；在构巢曲
第 22 卷第 4 期 2014 年 12 月
纤 维 素 科 学 与 技 术 Journal of Cellulose Science and Technology
Vol. 22 No. 4 Dec. 2014
文章编号：1004-8405(2014)04-0075-08
锌指蛋白在丝状真菌纤维素酶基因表达调控中的研究进展
锌指蛋白是一类具有手指状结构域的转录因子，对基因表达调控起重要作用，锌指蛋白家族是真核生 物中 DNA 序列特异性结合的转录因子中最大的家族之一[1-2]。最早由诺贝尔奖获得者 Klug 和同事在爪蟾 转录因子 IIIA（TFIIIA）蛋白中发现，该蛋白是由一个 Zn2+连接一对 Cys 和一对 His 并折叠成具有内部疏 水核心的结构。锌指蛋白发挥调控作用的关键是存在锌离子，锌指可以结合到 DNA、RNA 和 DNA-RNA 杂交双链分子上，在转录和翻译水平上调控基因的表达[3]。 锌指蛋白普遍存在于真核生物中， 近年来， 发现其广泛存在于丝状真菌纤维素酶基因表达调控过程中。 本文将重点对参与丝状真菌纤维素酶基因调控的锌指蛋白类型、具体调控作用进行阐述，并结合本实验室 的研究结果总结锌指蛋白在丝状真菌产纤维素酶中的应用。
杨 帆， 王 娟*
（深圳大学 生命科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东 深圳 518060） 摘 要：简要介绍了 C2H2 型、C4 型和 C6 型三类锌指蛋白，分别从三类锌指蛋白总结了其在丝状真菌
纤维素酶基因表达调控中发挥的作用，举例分析了锌指蛋白在纤维二糖水解酶Ⅰ和纤维二糖水解酶Ⅱ 编码基因上表达调控的过程，结合相关研究总结了锌指蛋白在丝状真菌产纤维素酶中应用，最后指出 通过该方面研究将有助于在分子水平上揭示纤维素酶表达调控的机理，为高效率、低成本生产纤维素 酶奠定基础。 关键词：丝状真菌；锌指蛋白；纤维素酶；半纤维素酶；基因表达调控 中图分类号：Q933 文献标识码：A
收稿日期：2014-08-27 基金项目：深圳市基础研究计划项目（JCYJ20120613115323982） 。 作者简介：杨 帆（1989~） ，男，硕士研究生；研究方向：嗜热真菌纤维素酶基因表达调控。 通讯作者：王 娟（1975~） ，女，副教授；研究方向：应用微生物学和基因工程。wangjuan@
第4期
杨 帆等：锌指蛋白在丝状真菌纤维素酶基因表达调控中的研究进展
77
霉中， 蛋白 PacC 通过介导 pH 值的变化间接对木聚糖酶基因 xlnA 和 xlnB 进行调控， 但由于在 xlnA 和 xlnB 的上游序列也能发现 PacC 的一个或两个序列结合位点， 这被认为转录因子 PacC 可能也直接参与调控目的 基因[29]。 2.2 C4 型锌指蛋白 在曲霉属中，AreA 是一个总纤维素酶基因转录激活蛋白，含有一个高度保守的 Cys4 锌指结构域，同 时也调控着参与氮代谢的基因，经鉴定与粗糙脉胞菌中的具有一个锌指结构域 Nit2 为同源蛋白并都是 GATA 因子家族的成员之一[18]，其结合启动子的保守序列位点为 5’-HGATAR-3’，在构巢曲霉纤维素酶编 码基因 cbhA、eglA、eglB 中都能发现 AreA 序列结合位点[30]，虽然这些还末得到实验证明，但它是纤维素 在粗糙脉胞菌中， 蛋白 Nit2 在氮源限制条件下是一个 酶系表达重要的转录调控因子却已得到实验证实[31]； 编码氮源代谢酶的一个正调控因子，而 Goncalves 等发现 Nit2 结合在编码糖原合成酶启动子上游的顺式原 件上，基因敲除 nit2 后，发现缺失该基因的菌株丧失了糖原的积累功能，从而认为 Nit2 同时还是一个碳源 的抑制因子[32]。所以尽管锌指蛋白 AreA 与 Nit2 氨基酸序列同源，但功能上并不是完全保守的。 2.3 C6 型锌指蛋白 双核锌簇类 Ace2 可能是木霉属丝状真菌所特有的 DNA 结合蛋白， 因为在其它属的丝状真菌中尚未发 现其同源蛋白[33]，这种调控蛋白是结合在 xyn2 启动子上，该蛋白在诱导前期具有抑制基因表达的作用， 后期具有激活作用[34]。 双核锌簇类 XlnR 是从黑曲霉中分离的第一个丝状真菌纤维素酶和木聚糖酶基因转录激活蛋白，与棘 孢曲霉、四孢脉孢菌（Neurospora tetrasperma）氨基酸序列同源性各为 81%、54%，在棘孢曲霉中发现当 存在纤维二糖时 XlnR 依赖型的信号通路能激活调控纤维素酶和木聚糖酶的基因，后来在米曲霉中又发现 XlnR 具有调控多达 30 个木聚糖和纤维素分解的基因，并能降解-1,4-木聚糖、阿拉伯木聚糖、纤维素、木 葡聚糖和单一糖的代谢，同时在里氏木霉中也存在与 XlnR 同源的木聚糖酶调控蛋白 Xyr1，它们都属于 GAL4 家族的双核锌簇类转录因子，两种转录因子在 DNA 结合序列特异性方面存在差异，可能的原因是 在结合 DNA 的双核锌指结构域中存在一个氨基酸的差异[35-38]；真菌中的内切-甘露聚糖酶是一种在工业 上得到广泛应用的酶，第一个调控内切-甘露聚糖酶的 Zn(Ⅱ)2C6 锌指类激活蛋白 ManR 是在米曲霉中发 现的，同时具有上调萄甘露聚糖和半乳甘露聚糖降解酶的作用，与产黄青霉氨基酸序列同源性达到 另外还一个之前末报道过的 Zn(Ⅱ)2C6 锌指类激活蛋白 ClbR 在棘孢曲霉中参与了 XlnR 依赖型和 61%[2,39]； 非依赖型纤维二糖和纤维素应答诱导通路， 这类蛋白也存在产黄青霉中， 氨基酸序列同源性达到 63%[39-40]。 另外还有两个相当保守的双核锌簇类蛋白 Clr-1 和 Clr-2 存在于脉胞菌属及构巢曲霉中， 是子囊菌中保 守和必要的转录因子，这两个转录因子在菌株只有纤维素为碳源的培养基上能生长与产生纤维素降解酶时 是必要的，但与半纤维素木聚糖降解酶的产生无关，并且 Clr-1 在功能上对 Clr-2 的表达和有效利用纤维二 糖都是必要的[41]。 到目前为止，许多在丝状真菌中具有调控纤维素降解酶基因的锌指蛋白类已经被鉴定，尽管其中有些 转录因子的氨基酸序列的同源性很高，但它们的功能并不是完锌指结构由两个及以上的半胱氨酸和/或组氨酸组成，通过锌离子形成四面体结构。锌指广泛存在于真 核生物中，在不同种属中典型锌指的数目和相邻锌指间连接的长度有很大不同。根据锌指蛋白高度保守的 氨基酸序列，可以将其主要分为三大类：第一类 Cys2His2(C2H2)，FOG 是属于它的子类，因为它们都含有 C2H2 和 C2HC 共有序列[4]，每一个重复单位都是由一个保守的氨基酸序列与锌离子的相互作用构成的，即 这一类型的成员结合核酸作为一个单元[5]；第二类 Cys4(C4)，还包括 GATA、LIM 和核接受蛋白；第三类 ，因此也称为锌簇，双核锌 C6 锌指蛋白，其包含六个半胱氨酸组结合两个锌离子的 DNA 结合域（DBD） 它们的共有氨基酸序列分别为： Cys-X2-4-Cys-X12-His-X3-5-His、 Cys-X2-Cys-Xn-Cys-X2 簇或 Zn(Ⅱ)2C6 蛋白， -Cys-Xn-Cys-X2-Cys、Cys-X2-Cys-X6-Cys-X5-12-Cys -X2-Cys-X6-8-Cys。 在真核基因组中，锌指蛋白是最丰富的一类蛋白。它们的功能有较大差异，包括 DNA 识别、RNA 包 装、转录激活、调控细胞凋亡、蛋白折叠、组装及与油脂的结合。在锌指蛋白中，具有经典 C2H2 型的锌