非受体型酪氨酸激酶Syk蛋白的提取与纯化

论著

文章编号:1007-8738(2004)02-0230-04

非受体型酪氨酸激酶-Syk 蛋白的提取与纯化

单保恩1,董 青1,李宏芬1,陈 晶1,董金琢2,马 洪2

(1河北医科大学第四医院科研中心,河北石家庄050011;2美国MD 技术公司,Mo 63021,美国)

收稿日期:2003-06-07; 修回日期:2003-09-18基金项目:美国MD 技术公司合作课题基金资助(2002年)作者简介:单保恩(1962-),男,河北邯郸人,教授,博士生导师.

Tel:(0311)6033941-290;Email:baoenshan@yahoo.c

Extraction and purification of non -recep -tor type PTKs -Syk

SHAN Bao -en 1,DO NG Qing 1,LI Hong -fen 1

,C HE N Jing 1,DO NG Jin -zhuo 2,MA Hong 2

1

Research Center ,The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China;2MD Technologies Inc.845Pheasant Woods Drive Manchester,Mo 63021,USA

Abstract

AIM:To extract and purify Syk protein from Sf 21cells transfec-t ed by syk gene.METHODS:Sf 21cells were transfected with recom bi nant syk gene.After 48h of incubation at 28 ,the transfected cells were collected and sonicated with Sonfier son-i cator on ice.Filtered cell extract was loaded onto a R eactive Yellow -3res i n column and Toyopearl AF -H eparin -650M colum n respectively.The character of Syk protein in the fractions were i dentified by SDS -PAGE,W estern blotting and IEF.RESULTS:225m g of protein containing Syk were obtained from Sf 21cells (2.5 109)extract.There were two subpopulations in the elu -tion of Reactive Yellow -3resin column with the same relative molecular mass (M r )72 103.The two subpopulations were then applied on Toyopearl AF -H eparin -650M column and two pure proteins were obtained.The results of SDS -PAGE,W es-t ern blotting,and IEF showed the two proteins having the sam e relative molecular mass (72 103),corresponding to Syk,but with different pI.CONCLUSION:The y ield of Syk was 8m g from 2.5billion cells and the purity was >95%.The two purified Syk proteins have the sam e M r and different pI.The purified Syk protein can be applied to study Syk s m echanism,produce ant -i Syk antibody and invent Syk diagnosis kit,etc .Keywords:Syk;purification;chromatography;Sf 21cells

摘要

目的:从转染syk 基因的Sf21细胞中提取、纯化免疫相关因子

Syk 蛋白。方法:将syk 基因转染Sf21细胞,于28 培养48h,收集细胞,用超声波破碎仪裂解细胞,提取裂解液中总蛋白,用Yellow -3凝胶和Toyopear-l AF -Heptin -650M 凝胶层析柱分离、纯化。层析液中的Syk 蛋白存在和性质,用SDS -PAGE 、免疫印迹实验和等电聚焦实验鉴定。结果:从25亿个Sf21细胞裂解液中提取了含有Syk 的225mg 蛋白质。经Yellow -3凝胶层析分离,得到两个亚种的Syk 蛋白,相对分子质量(M r )均为72 103。进一步用Toyopear-l AF -Heptin -650M 凝胶层析纯化后,得到两个纯的Syk 蛋白,SDS -PAGE 、免疫印迹实验结果显示,两种Syk 的M r 均为72 103,与Syk 的理论相对分子质量吻合。但等电聚焦实验显示,这两种Syk 蛋白成分具有不同的pI 值。结论:从25亿个转染syk 基因的Sf21细胞中纯化出8mg Syk 蛋白,纯度高于95%。这两种Syk 的M r 虽然相同,但具有不同的pI 值,是两个亚种。这些Syk 可用于研究Syk 的作用机制、抗Syk 抗体的制备和Syk 诊断试剂盒的制备等。关键词:Syk;分离纯化;凝胶层析;Sf21细胞中图分类号:R392.11 文献标识码:B

非受体型酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk),是一种B 细胞激活信号转导中最重要的激酶

[1]

,与T 细胞激活中的ZAP -70属于同一个PTK 家

族,M r 为72 103。Syk 在T 细胞和B 细胞的成熟和活化过程中起关键作用[2]。该酶除有激酶活性中心SH1之外,还有两个SH2结构域,因而成为磷酸化I -TAM 招募的首选对象。被招募的Syk 立即成为Src 作用的第二个靶目标,进而启动B 细胞活化信号转导的三条主要途径(磷脂酰肌醇途径、MAP 激酶相关途径和磷酸肌醇3激酶途径),激活各种转录因子转位进入细胞核,与基因启动子区域中各种顺式作用元件或DNA 小盒结合,使相应基因发生转录激活和产物表达,调整B 细胞等细胞克隆的蛋白质表达、细胞分化或凋亡。研究发现,Syk 不但是免疫调节因子,在肿瘤发生发展中也发挥着重要作用。但是,用于研究Syk 的蛋白标准品、抗体和诊断用试剂很难取得。我们介绍从转染s yk 基因的Sf21细胞中提取、纯化免疫相关因子Syk 蛋白。