免疫组化 protocol 方法与原理大全

免疫组化（SP 法） 第一天 (5h)
准备：60℃ 烘片2-4h
1. 二甲苯脱蜡1 30min
2. 二甲苯脱蜡2 30min
3. 100% 乙醇 10min 2次
4. 95% 乙醇 3min
5. 85% 乙醇 3min
6. 75% 乙醇 3min
7. ddH 20 1min 2次 轻晃以防掉片
8. 抗原修复：
使用1L 烧杯，9ml 柠檬酸（0.1M 现配）溶液和41ml 柠檬酸钠（0.1M ）加450ml ddH 20（ph=6）罩上锡纸，封烧杯口，扎洞若干，煮沸20min （可先煮沸再放片子，也可以先放片子再一起煮，温度先调至420℃多，煮沸后调到250℃左右，计时15-20min ）之后自然冷却（30-40℃） 9ml 柠檬酸配法：9ml ddH 20加0.18g 柠檬酸。

可以直接称取0.18g 柠檬酸加41ml 柠檬酸钠加450ml 水
0.1M 柠檬酸钠配法：29.41g 柠檬酸钠加入1L 蒸馏水中，或14.7g 加入500ml 蒸馏水中
9. 3%H 202孵育10min （200ml
，盒子装，现配，用甲醇稀释30%H 202至3%H
202）以消除内源性过氧化物酶活性（内源性过氧化物酶能与HRP 反应，造成假阳性），PBS 冲洗3min 3次
10. 加试剂A （山羊血清，起到封闭作用）一滴（蓝色）室温孵育10-15min 盖盖防干，倾去勿洗，先甩再擦（试剂A,B,C 放在1号冰箱侧门，擦干玻片，放在湿盒里，盒子两侧不要放玻片，以防接触到盒壁，抗体流出，要求试剂刚好覆盖组织，全部滴完计时10min ，用黄枪头抹匀试剂）
11. 加一抗，4℃过夜，25-50ul 每个组织，一抗用PBS 稀释，4℃放置，加完一抗后，先不要盖盖，放到冰箱里后再盖盖
第二天(3h)
12.PBS 3min 3次（将1xPBS倒进盒子里，里面放架子，片子甩干后放进架子里）
13.加试剂B（黄色）室温孵育10-15min，盖盖（试剂B是生物素化的二抗，能与一抗结合）
14.PBS 3min 3次
15.加试剂C（橙黄色）室温孵育10-15min，盖盖（试剂C是HRP标记的链霉亲和素，一个亲和素可以与四个生物素非共价键结合，不可逆，结合紧密。

因此试剂C与试剂B会结合）
16.PBS 3min 3次，置于ddH20中
17.DAB避光显色，显色后置于ddH20中（准备一个小烧杯，装有ddH20，DAB显色后在烧杯中洗下）DAB的配法：1. 关灯2. 取1号冰箱里的DAB①② 3. 取棕色EP管，12张片子约用1mlDAB，每张片子需3-4滴4. 1ml DAB②加一滴DAB①（剧毒），配好后避光放置
18.苏木精1min左右（苏木精伊红避光，苏木精配好后需要用纱布过滤）
19.流水冲洗2min
20.盐酸酒精分化2-3s（快速涮两下）
21.流水冲洗反蓝20min
22.75% 乙醇4min
85% 乙醇4min
95% 乙醇4min
100% 乙醇4min
23.二甲苯1 10min
24.二甲苯2 10min
25.封片，鼠房抽屉里有中性树胶，长枪头沾取滴1-2滴（长盖玻片滴4滴）拿出片子，擦去背面多余的二甲苯，二甲苯易挥发，与中性树胶可溶，在组织旁滴上中性树胶后，立刻盖上准备好的盖玻片，放置通风处过夜晾干。