大学本科生物化学实验理论相关问题

细胞破碎

1 常用的细胞破碎的方法有哪些？

机械法，酶法，化学法，物理法

2 有机溶剂法破碎细胞原理，常用的有机溶剂有哪些

有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳。比如笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高级醇等

3 酶法破碎细胞原理

酶分解作用

4 反复冻融法破碎细胞原理

通过反复将细胞放在低温下突然冷却和室温下融化达到破壁作用

层析技术

1.什么叫层析技术？常用的层析技术有哪些？

层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相，从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。常用技术有分配层析，离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和层析，吸附层析

2.指出常用层析技术的应用范围。

凝胶层析法：⑴脱盐；⑵用于分离提纯；⑶测定高分子物质的分子量；⑷高分子溶液的浓缩

离子交换层析法：主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子

高效液相层析法：⑴液-固吸附层析；⑵液-液分配层析；⑶离子交换层析

3．SephadexG-100凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么？

大小不同的分子经过的路线长短不同而达到分离作用

4.用Sephadex G25脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰？

蛋白质

5.相对分子量为8万和10万的蛋白质能否在SephadexG-75柱中分开？为什么？

不能,分子量差距太小

6.将分子量分别为a（90 000）、b（45 000）、c（110 000）的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析，正常情况下，将它们按被洗脱下来的先后排序。

c、a、b

7.离子交换层析与凝胶过滤哪种分辨率高？

离子交换层析较高。

8.离子交换层析的原理？

根据自交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离

主要依赖电荷间的相互作用,利用带电分子中电荷的微小的差异进行分离

9.如果样品中只有Ala和His(Ala pI=6.0,His pI=7.6)，在pH4条件下，这两种氨基酸那一种与CM（阳离子交换剂）结合的紧密？如果用pH4-7的洗脱液梯度洗脱，那种氨基酸先洗脱出来？

Ala

10. 柱层析时湿装柱的注意事项有哪些？

用水灌注、不能有气泡

11.说说离子交换层析中洗脱液的选择原则

①阴离子交换剂选用阳离子缓冲液（如氨基乙酸、铵盐、Tris等），阳离子交换剂选用阴离子缓冲液（如乙酸盐、磷酸盐等），以防缓冲离子参与交换过程，降低交换剂的交换容量。②缓冲液pH值的选择要使被分离物质的电荷与平衡离子电荷的正负性相同。③选用的缓冲系统对分离过程无干扰。④要确定一定的离子强度。

电泳原理

1.常见的凝胶电泳有哪几种？说明其主要用途，并比较其主要优缺点。

A．醋酸纤维素薄膜电泳。用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中。优点是操作简单、快速、廉价缺点是它的分辨力不够高。（比聚丙酰胺凝胶电泳低）

B．凝胶电泳。用于分子生物学、遗传学和生物化学，如大的DNA或者RNA分子的分离，酶谱法等。优点是操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。

C．等电聚焦电泳。应用蛋白质和两性分子的分离等。两性优点是分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定蛋白或多肽的等电点。缺点是需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白。

2.从分离原理和实际应用两方面简单说明SDS-PAGE和PAGE技术方法有何主要区别？

非变性凝胶电泳，也称为天然凝胶电泳，与变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程中和电泳后都不会变性。最主要的有以下几点：

A. 凝胶的配置中非变性凝胶不能加入SDS，而变性凝胶的有SDS。

B. 电泳载样缓冲液中非变性凝胶的不仅没有SDS，也没有巯基乙醇。

C.在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，不像SDS-PAGE电泳中蛋白质分离只与其分子量有

关。

D.非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正极泳动。非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。 5. 因为是非变性凝胶电泳，所有的电泳时候电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性，而且步骤都要在0-4度的条件下进行，这样才可以保持蛋白质的活性，也可以降低蛋白质的水解作用。这点跟变性电泳也不一样。

所以与SDS-PAGE电泳相比，非变性凝胶大大降低了蛋白质变性发生的机率

3.影响蛋白质电泳分辨率的主要因素有哪些？

系统的pH值；.电场强度；.温度；电渗作用

4.聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白时，使用的电泳缓冲液PH＝8.3，那么样品应点在哪端？为什么？

在负极。因为电泳缓冲液PH＝8.3时，血清蛋白的几种蛋白电离后都带上负电荷，所有只有点样在负极端，外加电压后，才能向正极移动，彼此才能分开。（PH值大于等电点时带负电荷 ,小于等电点时带正电）

蛋白质含量测定

1 紫外吸收法与Folin-酚比色法测定蛋白质含量相比，有何缺点及优点？

紫外吸收法优点：简单快速，灵敏度高。缺点：核酸干扰

2 若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？

校正:计算待测蛋白质溶液的OD280/OD260比值后，查(紫外分光光度法测定蛋白质含量校正数据表）校正因子“F”值，根据经验公式--蛋白质浓度(mg/ml)=F×1/d×OD280×D计算该溶液的蛋白质浓度；D-溶液的稀释倍数，d比色杯的厚度（cm）

3 试说明考马斯亮蓝G250法的优缺点。

考马斯亮蓝G250 当该染料与蛋白质结合后为青色，在波长595nm有最大吸收；其吸收值与蛋白质含量成正比。灵敏度高（0-1000 μg/mL ），是常用的微量蛋白质快速测定法。缺点：、大量的去污剂如TritonX-100，SDS等严重干扰测定。B、蛋白质与改染料2min反应达平衡，其结合物在室温下1h内稳定。时间太长，结果偏低。

离心技术

1.相对离心力为30，000×g，转头平均半径为10cm,求转速r/min （rpm）? （两种方法）

2.制备离心机有哪几种类型？比较它们的特点和用途。

A．普通离心机；特点型号很多，容量不同，转速不同，控制不精密；用途固液沉淀分离。

B．高速离心机；特点型号较多，转速不同，有控温装置，控制精密（时间、转速），用途菌体、细胞碎片、细胞器等的分离。

C．超速离心机；特点控制精密：时间控制、温度控制、转速控制、真空系统；细胞器分级分离、病毒、DNA、RNA、蛋白质分离提纯等。

3.在离心场中物质沉降的速度与哪些因子有关

颗粒的沉降速度不仅与离心力有关，而且与颗粒大小、密度以及介质黏度有关。

4.差速区带离心法和等密度离心法的区别是什么？

差速区带离心法：根据分离样品颗粒的不同沉降速度而分层；等密度区带离心法：根据微粒的不同密度而分层。

5.常用密度梯度的材料有哪些？

糖类（蔗糖）、无机盐（氯化铯）、硅溶胶（Ludox）、有机碘化物。

6.几种离心技术的特点？

A．沉淀离心：选定一定的时间、速度进行离心，使样品液中的大的固型物与液体分离，从而获得沉淀或上清夜。又称为固液分离法。使用普通离心机。

B．差速分级离心：在均匀介质中，利用各种物质粒子沉降速度的不同而分批分离的方法。

C．区带离心法：利用各种粒子的沉降速度和浮力密度差异，当一定粒子到达与其密度相同的梯度位置时则停止沉降，不同粒子处于不同位置，则得到了分离。

沉淀技术

1 蛋白质沉淀的常用方法有哪些

盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法

2什么是盐析，盐析的原理，列举盐析时常用的盐

一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。

原理：蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。在某一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度各不相同，由此可达到彼此分离的目的。

主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠

3简述等电点沉淀及原理

通过调节溶液的pH值至某种溶质的等电点(pI)时，使其溶解度降低，沉淀析出，而与其他组分分离的方法称为等电