化学毒物的一般毒性作用-亚慢性慢性毒性(6)

第五章
化学毒物的一般毒性作用
华南农业大学食品学院柳春红liuch@
一亚慢性毒性作用： 亚慢性毒性的概念 亚慢性毒性试验的目的 亚慢性毒性试验的设计二慢性毒性作用： 慢性毒性的概念 慢性毒性试验的目的 慢性毒性试验设计
§2 亚慢性和慢性毒性试验
(一) 概念：
亚慢性毒性(subchronic toxicity)是指人或实验动物连续较长期接触时外源化合物所引起的中毒效应。

(不超过生命期限的10%）（大鼠90天）
慢性毒性(chronic toxicity)是指人或实验动物长期(甚至终生)反复接触外源化学物所产生的毒性效应。

( 2年)
一、亚慢性和慢性毒性试验的概念、目的
（二）试验目的：
1.确定受试物亚慢性和慢性毒性的效应谱，为在急性及亚急性毒性试验中发现的毒作用提供新的信息，并发现在急性及亚急性毒性试验中未发现的毒作用；
2.研究受试物亚慢性和慢性毒作用的靶器官；
3.研究受试物亚慢性和慢性毒性剂量—反应（效应）关系，确定其观察到有害作用的最低剂量（LOAEL）和未观察到有害作用的剂量（NOAEL），提出此受试物的安全限量参考值。

4.研究受试物亚慢性和慢性毒性损害的可逆性;
5.亚慢性毒性试验为慢性毒性试验的剂量设计及观察指标选择提供依据;
6.为毒作用机制研究、为将毒性研究结果外推到人提供依据。

（三）实验动物
1、实验动物选择
亚慢性毒性试验
年龄：离乳不久
大鼠80~100g 狗8~12月小鼠15g左右数量：小动物≥20
大动物≥6性别：雌雄各半
慢性毒性试验
年龄：初断乳
大鼠50~70g 狗<8月
小鼠10~15g 数量：小动物≥40
大动物≥8性别：雌雄各半
实验动物分级
•原国家实验动物微生物及寄生虫等级及监测分类：
分四级：普通级
清洁级
无特定病源级（SPF）
无菌级
•2001年新国家标准
取消实验大鼠、小鼠的普通级
犬和猴分普通级和SPF级
亚慢性清洁级以上等级大小鼠
屏障设施平面布局图
2、实验动物染毒期限：
亚慢性毒性试验
–工业毒理学——1-3个月
–食品毒理学——3-6个月
–环境毒理学——3-6个月
慢性毒性试验
–工业毒理学——6个月或更长
–食品毒理学——1年以上或2年
–环境毒理学——1年以上或2年
–致癌试验——接近或等于动物的预期寿命
亚慢性毒性试验
经口、呼吸道、皮肤、注射染毒频率：每日一次,连续给予(≥3个月,6次/周)
呼吸道: 2-6小时/日
工业毒物可缩短至1小时
环境污染物可延长至8小时
慢性毒性试验
多采用经口染毒
染毒频率：5-6天/周
长期呼吸道染毒:
专用动式吸入染毒装置
3、实验动物染毒方式和时间
–亚慢性毒性的剂量选择•阴性对照组
•低剂量组
•中剂量组
•高剂量组
急性毒性的阈剂量
5%~15% LD50
•组距：
2~4倍，最低不小于2倍–慢性毒性的剂量选择
•阴性对照组
•低剂量组
•中剂量组
•高剂量组
亚慢性LOAEL或其1/5~1/2
10%LD50
•组距：
2~4倍，不超过10倍
（四）试验分组和剂量设计
（五）观察指标
亚慢性和慢性毒性试验检测各种毒性终点的流程图1.一般综合性观察指标：
•外观体征、行为活动、体重、食物利用率–与对照组处于相同的喂饲条件下，如果受试组动物
体重增长比对照组低10％，就可以认为是由受试化
学物所引起的毒效应。

–如果各剂量组体重增长改变有剂量-反应关系，就可
以肯定这是一种综合毒性效应。

–亚慢性毒性试验应每周测体重一次，3个月以后可1
次/2周；
–慢性毒性试验，最初13周每周测体重一次，以后如
动物健康状况无明显改变可每2周或每月测体重一次
2. 实验室检查：血、尿常规、血液生化指标
血液学检查：红细胞计数、血红蛋白含量、白细胞计数及分类、血小板计数、凝血时间等。

血液生化检查：主要为血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮、肌酐、总蛋白、白蛋白、血糖、
总胆固醇、总胆红素等
尿液检查：外观、pH值、蛋白、糖、潜血(半定量)和沉淀物镜检等，可提供与毒物有关的中间代谢产物及靶器官毒性的证据。

注意
•不影响实验动物生理功能的最大取血量为其总血量的10％；总血量约为50ml／kg
•用大鼠作实验动物，亚慢性毒性试验一般在试验结束时进行实验室检查，必要时可在染毒期间测定一次；慢性毒性试验则在实验开始后每隔6个月各剂量组雌雄部分大鼠及结束时(全部)各检查一次。

•用狗作实验动物，应在染毒前、染毒期间、染毒结束时进行实验室检查。

3. 系统尸解和病理学检查：
脏器湿重、脏器系数（脏/体比值）、病理学检查
脏器系数或称脏体比值:
指某个脏器的湿重与单位体重的比值，通常是每
100克体重中某脏器所占的质量，如肝／体比，
就是(全肝湿重／体重)x100％。

4.特异性指标：
特异性指标是反映外源化学物对机体毒作用本
质的特征性指标，并常与其毒作用机制有关。

实际上，所谓特异性指标就是生物学标志(主要
是效应标志)
常见化学毒物所致主要靶器官损伤
五、亚慢性、慢性毒性作用评价
•亚慢性毒性进行评价时，应包括三个步骤：
①明确化学物质的毒效应。

通过全面观察、准确检测和综合分析，对接触化学毒物的个体和群体出现与对照组相比有统
计学差异的有害效应以及剂量-反应（效应）关系作出判断，确定机体出现的各种有害效应；
②根据在试验早期和最低剂量组出现有统计学意义的指标变化，确定毒效应的敏感指标，并依据指标出现变化的情况来确
定阈剂量和或最大无作用剂量。

③根据阈剂量和／或最大无作用剂量，对化学毒物的亚慢性毒性作出评价。

亚慢性试验评判：
NOAEL < 100⨯Intake human
——放弃
100⨯Intake human< NOAEL < 300⨯Intake human ——继续慢性试验
NOAEL > 人的可能摄入量的300倍
——不必慢性试验，直接进行毒性评价
慢性试验评判：
•NOAEL < 50⨯Intake human ——放弃
50⨯Intake human < NOAEL < 100⨯Intake human ——相关专家共同评议是否用于食品
NOAEL > 人的可能摄入量的100倍——允许用于食品，并制定卫生标准
•慢性毒性评价
一、基本概念
二、蓄积毒性试验方法及其评价
§3 蓄积毒性
化学毒物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。

但是，当化学毒物反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学毒物的蓄积作用(accumulation)。

一、基本概念
蓄积作用实际上有二个含义：物质蓄积(material accumulation)功能蓄积(functional accumulation)
二、蓄积毒性试验方法及其评价
–化学毒物的蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础
–因此研究化学毒物在机体内的蓄积性是评价化学毒物能否引起潜在慢性毒性的依据之一，也是卫生标准制订过程选择安全系数的主要依据。

蓄积毒性目的
–通过试验求出蓄积系数K，了解化学毒物蓄积毒性的强弱–为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。

(一)蓄积系数法
蓄积系数(accumulation coefficient)是多次染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量[ED50(n)]与一次染毒使半数动物出现相同效应(或死亡)的剂量[ED50(1)]的比值，即：
K＝ED50(n)/ED50(1)
K＝LD50(n)/LD50(1)
1．固定剂量法
•先求出LD
50
（常选用大/小鼠灌胃或腹腔注射方法进行染毒）
•然后选取相同条件的40只(或更多)实验动物，分为两组（染毒组，对照组），每组至少20只，雌雄各半。

•试验组在1/20～l/50LD
50
的范围内选定一个剂量
•每日以固定剂量、定时和相同途径进行染毒,试验期间观察记录每组动物死亡数。

•当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。

此时，计算累积总接触剂量[LD50(n)]，根据公式计算K值，然后依表6-5进行评价。

•但若接触剂量已累积达到5个LD50剂量，也可终止试验。

2．剂量递增法
0.1LD
50*4天0.15LD
50
*4天0.22LD
50
*4天……
当化学毒物引起动物累积死亡一半时即可终止试验，计算K值进行评价。

在试验第2l天也可结束试验，因为这之前如果动物没有死亡或死亡数不足一半，说明其累积剂量已达5.26LD
50
，即K＞5。

3．剂量固定的20天蓄积法
通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机分为5个组，包括阴性对照组和1/20LD
50
、l/10LD
50
、
1/5LD
50
和1/2LD
50
四个剂量组，每组动物数10只，雌雄各半。

每日染毒一次，连续染毒20天。

观察每组雌雄合计的死亡动物数量。

试验结束时根据下列标准进行评定：
①各剂量组均无死亡，即为蓄积性不明显；
②如仅1/2LD50剂量组有死亡，其他组均无死亡，则为弱蓄积性；
③如1/20LD50剂量组无死亡，其他各组间死亡数有剂量反应关系时，则为中等蓄积性；
④如1/20LD50剂量组有死亡，且有剂量反应关系，则为强蓄积性。

(二)生物半减期法
生物半减期(biological half-life，t1/2):
进入机体的外来化学物由体内消除一半所需的时间，化学毒物在体内蓄积的速度和量与机体单位时间内吸收该物质的速度以及清除速度有关。

一般地，t1/2较短的化学毒物达到蓄积极限所需的时间也短，t1/2长者达到蓄积极限的时间也长。

•如果化学物每次进入机体的间隔时间比生物半减期短，则其蓄积可能性极大。

•反之，如每次进入机体的间隔时间比生物半减期长，则其蓄积可能性极小。

•如果两者相等，那么,每经过一个半减期,体内的蓄积量相当于这一时期内进入机体总量的一半与前一阶段蓄积总量一半的代数和。

•在等间距、等剂量染毒的条件下，化学物在体内经5～6个生物半衰期即可达到蓄积极限，此时理论蓄积量为极限值的96.9～98.4％。

此后继续染毒蓄积量也基本上不再增加。

•蓄积极限量＝每日吸收量×tl／2×1.44
0.031250.06250.1250.250.5化学物在体内的蓄积曲线
SUM=96.875%。