分子标记技术及其在园林植物遗传育种中的应用

河南农业大学分子标记技术及其在植物遗传育种中的应用摘要：概述各种常用分子标记技术RFLP，RAPD，AFLP，SSR，ISSR，SCAR，CAP s，SNP等技术，综述了分子标记技术在植物遗传育种中的应用。

关键词:分子标记植物遗传育种Molecular Marker and Its Application in Garden Plant Genetics andBreedingAbstract：The principals of several commonly used molecular marker including RFLP,RAPD,AFLP,SSR,ISSR,SCAR,STS and CAPs，are introduced and the applications of molecular markers in plant breeding are summarized from the aspects varieties identification, the conservation of germplasm resources, pedigree analysis and classification gene localization, construction of genetic map．Key words：molecular marker；Plant；Genetics and Breeding 近年，随着生物技术的快速发展，分子标记技术在诸多领域得到应用，尤以农业、医药业、畜牧业等行业应用得最多。

分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的遗传标记。

分子标记的出现，使植物育种的“间接选择”成为可能，大大提高了遗传分析的准确性和选育种的有效性，因而在遗传育种领域愈来愈受到重视。

在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致分为两大类：一类是以Southern杂交技术为核心的分子标记(如RFLP)，此类被称为第一代分子标记；以PCR技术为核心的分子标记(如STS、RAPD、AFLP、SSR等)称为第二代分子标记，单核苷酸多态性(SNP)标记称为第三代分子标记，这也是以PCR技术为基础的分子标记技术。

现分别介绍其原理及在植物育种上的应用。

1分子标记在植物育种上的特点分子标记育种(molecular mark-assist selection，MAS)是借助分子标记在DNA水平上对遗传资源或育种材料进行选择，对作物产量，品质和抗性等综合性状进行高效改良，并针对目标性状基困连锁进行优良植株筛选，是现代分子生物学与传统遗传育种相结合的新品种选育方法。

与传统育种相比分子标记的优势是：(1)传统育种通过性状间接筛选目的基因，分子标记则通过直接与目的基因连锁进行筛选，因此，后者比前者准确，特别是在一些表现型与基因型之间对应关系较差时的筛选，(2)传统育种需要在成熟期才能筛选，分子标记筛选则可以不受植物生长发育期的限制，在苗期就可以筛选，而且不影响植株生长，(3)传统方法一次只能标记一个基因，分子标记筛选则可以同时筛选多个目的性状基因，(4)分子标记筛选利用了控制单一性状的多个等位基因，避免了传统育种通过表现型而获得不纯植株的缺陷；(5)分子标记筛选样品用量少，可以进行非破坏性筛选，从而加速育种进程，提高育种效率。

2常用分子标记的技术及其在植物育种上的应用2.1限制性内切酶片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP，简称限制片段长度多态性)RFLP是以分子杂交技术为基础的标记技术，其原理是碱基的突变、缺失、重排或是一段DNA的重排或插入，导致限制性内切核苷酸酶的酶切位点分布发生改变，得到的切割片段在数量和长度上不同，从而产生多态性。

用限制性内切酶切割基因得到不同片段，然后经琼脂糖凝胶电泳分离，印迹到尼龙膜或硝酸纤维膜上，再用DNA探针与同源序列杂交，经放射自显影或酶学检测。

RFLP的优点是检测到的等位基因具有共显性，能区分纯合子和杂合子，能稳定遗传。

甘娜[16]等（2006）利用RAPD、叶绿体和线粒体基因组PCR2RFLP标记系统评价了大花蕙兰20个品种的遗传多样性。

其结果表明RAPD标记揭示的大花蕙兰遗传多样性最高, 其次为cpDNA PCR-RFLP标记, 而mtDNA PCR-RFLP标记揭示的遗传多样性最低。

但是大花蕙兰的叶绿体和线粒体基因组比较保守, 遗传多样性较低, 不能作为聚类分析的依据。

张立平[29]等（1996）提出简便易行的葡萄染色体DNA的提取纯化方法，并对部分葡萄种及品种进行RFLP鉴定，以期用分子生物学方法完善我国葡萄分类，也为其它果树分类提供借鉴。

2.2 随机扩增多态性DNA(random amplification polymorphism DNA，RAPD)RAPD以DNA聚合酶链式反应(PCR)为基础，它的引物是一段任意寡聚脱氧核糖核苷酸单链片段(长度通常为8—10 bp)，在基因组DNA 上随机引物都有特定的结合位点区域。

一旦此区域的碱基突变或是DNA插序、重排、缺失，均会引起结合位点分布的变化，从而引起PCR扩增产物在数量和长度上不同，产生多态性。

加人随机引物，进行PCR扩增，得到长度不同的DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段，经染色显示相应区域内DNA的多态性。

由于使用多个引物，多态性的检测可以扩大到整个基因组，因此RAPD可用于构建基因指纹图谱。

RAPD[1](2012)技术操作简便，已大量应用于品种鉴定、遗传图谱的构建及进化关系研究（Kuginuki et al.，1997；徐炎等，2003；谭雪等，2009；Ramchiary & Lim，2011），存在稳定性和重现性较低的不足（Jones et al.，1997）。

朱华武[18]等（2005）为探明茄子抗青枯病的遗传机制,用RAPD技术对供试材料的抗青枯病基因进行了研究。

其结果是找到了一个与茄子抗青枯病亲本S3中的抗病基因紧密连锁的分子标记S264780，该标记与S3的抗病基因的交换值为4．32% , 遗传距离为4．33 cM。

但是试验中在抗病亲本S3和F2代抗病池中均能扩增出S264780 , 而感病亲本北京六叶茄和F2代感病池均缺失这条带。

徐炎[22]等（2003）以感病×抗病的葡萄种间杂交组合白玉霓×塘尾的F1代17个单株及塘尾自交一代16个单株为试材, 采用BSA法和RAPD 技术, 通过对155个随机引物的筛选, 获得了一个与中国野生葡萄抗白腐病基因连锁的RAPD标记OPP09-760 , 并在中国野生葡萄8个种的32个株系及欧洲葡萄16个品种中得到验证。

但是本研究获得的刺葡萄塘尾抗白腐病基因RAPD标记OPP09-760 ,仅为研究抗白腐病基因提供了一个突破点, 更多的RAPD标记及其与抗白腐病基因位点的距离及定位作图是诸多学者正在进行研究的内容。

秦贺兰[25]等（2002）用RAID技术分析了18个菊花品种DNA的多态性，其结果检测出两个品种特有的分子标记，‘大红托桂’有OPD15 (1200 bp)．‘玉翎管’缺失OPAl7(1100 bp)。

瓣型一致的品种间基因型相似系数较高。

但是本试验中筛选出的3个引物扩增出的多态性条带不能将黄秀芳和白秀两个品种的菊花花色区分开。

罗素兰[26]等（2001）利用随机扩增多态性DNA (RAPD) 在一个葡萄的种间杂交组合〕的F1 群体中发展分子标记,共产生了89 个稳定的RAPD 标记,连同4 个形态标记(花型、霜霉病抗性、果皮颜色、果汁颜色) 构建了一个葡萄RAPD 分子连锁图。

为毛葡萄连锁图谱的构建提供了一个连锁框架。

但是在图谱上进行更多形态性状的基因定位或找出与目标性状相连锁的其它标记, 是需要进一步填充更多的RAPD 标记。

王跃进[28]等（1997）用RAPD技术分析了葡萄属圆叶葡萄亚属及真葡萄亚属美洲种的相关性。

2.3扩增片段长度多态性(amplification fragment length polymorphism，AFLP)AFLP是通过限制性内切酶切割DNA产生不同长度的DNA片段来检测DNA的多态性。

其原理是用限制性内切核苷酸酶酶切DNA，在DNA片段的两端加上带有特定序列的。

接头”，然后用与接头互补的3/—端带有几个随机选择的核营酸引物进行特异PCR扩增。

只有与3/—端严格配对的DNA片段才能扩增。

3/—端的核苷酸序列决定了DNA片段的特异性。

最后用高分辨率测序凝胶将扩增产物分离，用放射性自显影或银染法检测。

该技术[1](2012)可在不了解某物种任何DNA 信息情况下用于DNA 多态性的检测，且多态性丰富，重复性高，稳定性好，是一种较为理想和有效的分子标记，被广泛地应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、基因表达调控研究等（Guo et al.，2003；Zhao et al.，2005；Ramchiary & Lim，2011；Shi et al.，2011）。

但操作相对较为复杂，成本较高，通常需要同位素、荧光或银染观察多态性，且多态性条带较难以转换成操作简单的PCR 标记（Guo et al.，2003）。

赵婷婷[2]等（2012）以番茄抗叶霉病的品种05HN36为母本，以感病品种051355为父本配置杂交组合，以亲本及其F2分离群体为研究材料，采用AFLP 技术筛选与抗叶霉病基因Cf12 连锁的分子标记。

其结果是通过对545对引物进行筛选，获得了6个连锁的AFLP标记。

但是AFLP 的成本高和操作复杂等缺点限制了它在育种工作中的实际应用。

刘富中[10]等（2008）采用AFLP分析技术和改良BAS法，通过512对E ／M引物组合的筛选，获得1个与茄子单性结实基因紧密连锁的AFLP标记E75／M53-70，该标记与单性结实基因间的遗传图距为15．38cM，可用于茄子单性结实性的鉴定和单性结实分子标记辅助育种，加速茄子单性结实基因的转育和利用。

但是通过试验可知茄子单性结实的遗传机制较复杂，存在多个单性结实基因的控制，不同材料的遗传特性不尽相同。

唐美玲[11]等（2008）利用AFLP分子标记技术, 筛选与山葡萄性别相关的分子标记, 同时将其转化为简单实用的SCAR标记, 可加快葡萄育种进程。

但是AFLP标记具有操作程序复杂、成本高等缺点。

因此, 有必要将与山葡萄性别相关的AFLP标记转化为简单实用的SCAR标记，并且用于山葡萄分子标记辅助育种。

罗建华[14]等（2006）以抗病的‘秋棚’和感病的‘欧洲8号’杂交获得的115份重组自交系(RIL)为材料, 采用集团分离分析法(BSA)和AFLP技术进行了黄瓜抗ZYMV-CH遗传规律和连锁分子研究，并将其转化成共显性的SCAR 标记SCAR3-109，作为黄瓜抗ZYMV辅助选择的分子标记。