生物药物质量控制的生化分析方法

生物药物质量控制的生化分析方法

摘要：总结生物药物质量控制的生化分析方法，从生物多肽蛋白类药物、核酸类药物、酶类药物、重组DNA药物等几方面分类阐述了生物药质量控制的具体技术方法。有助于研究和发展现代分析技术，加强生物药物质量控制，推动我国医药产业发展。

关键词：生物药物质量控制生化分析

Biological drugs quality control of biochemical analysis method

2007060221 liuyonggan

Abstract：Summarize biological drugs quality control of biochemical analysis method, It expounded classification for quality control of specific technical method from biological polypeptide protein drugs, nucleic acid drugs, enzymes drugs and recombinant DNA drug. Help to research and development of modern analytical technology, and strengthening biological drugs quality control, impelling our country medicine industry development.

Keywords：biological drugs quality control biochemical analysis

1 多肽与蛋白质类药物的主要分析方法

1.1 蛋白质药物的纯度分析

纯度控制是每一种药物都必需的质量保证手段。蛋白质的纯度检定方法有：PAGE、SDS-PAGE、CE、IEF、HPLC包括凝胶排阻层次、各种反相HPLC，离子交换色谱、疏水色谱等。鉴定蛋白质时，至少应该使用两种以上的方法，而且两种方法的分离机制应当不同，其结果判定才比较可靠。

1.2 多肽与蛋白质分子量的测定

根据蛋白质分子的不同理化性质，采用渗透压、粘度、超离心、光散射，凝胶层析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法，可以测定其分子量。使用较多的是超速离心法，凝胶层析法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法等。

1.3 蛋白质的定量测定

根据蛋白质的性质，蛋白质的定量方法有以下几类：

（1）物理性质：紫外分光光度法，折射率法，比浊法。

（2）化学性质：凯氏定氮法，双缩脲比色法，Folin-酚法，BCA法。

（3）染色性质：考马斯亮兰G-250结合法、银染、金染。

（4）其他：荧光激发。

BCA（bicinchnimic acid）是对一价铜离子敏感、稳定和高特异活性的试剂。在碱性条件下，蛋白质将二价铜离子还原成一价铜离子，后者与BCA形成紫色复合物，在562nm处具有最大光吸收，其吸收值与蛋白质浓度成正比。

（图1 BCA（bicinchnimic acid）是对一价铜离子敏感、稳定和高特异活性的试剂。）

1.4 生物质谱法

多肽和蛋白质的分子量可用MALDI/MS（基质辅助激光解吸离子化质谱法）或ESI/MS（电喷雾离子化质谱法）直接测定，用质谱法测定蛋白质的分子量简便，快速灵敏、准确。

2 核酸类药物的主要分析方法

2.1 紫外分光光度法测定RNA与DNA含量

核酸类药物多含碱基，具有共轭双键结构，对子外具有特征吸收，RNA和DNA对紫外的特征吸收处于260nm处。在260nm波长下，每1ml含1ugRNA溶液的光吸收值为0.022，每1ml含1ugDNA溶液的光吸收值为0.020。故测定样品在260nm处的吸收值即可测定样品中核酸含量，但应避免核苷酸与蛋白质杂质干扰。

2.2 地衣酚显色法测定RNA含量

核糖核酸与浓盐酸在100℃共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收。RNA在20～250μ g范围内，光吸收与RNA的浓度成正比。地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，DNA和其他杂质也能给出类似的颜色。因此测定RNA时可先测定DNA含量，再计算出RNA含量。

2.3 二苯胺法测定DNA含量

DNA分子中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解，产生2-脱氧核糖并形成ω-羟基-γ-酮基戊酸，后者与二苯胺试剂反应产生蓝色化合物，在595nm处有最大吸收，且DNA在40µg ~400µg范围内时，吸光度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。

（图2 ω-羟基-γ-酮基戊醛）

3 酶类药物的分析

酶类药物的主要质量指标是它的催化活力。酶的测活方法包括比色法、紫外分光光度法、气量法、旋光测定法、电化学法和液闪计数法等。

4 重组DNA药物中的可能杂质检查

重组DNA药物的可能杂质包括：残留外源性DNA，宿主细胞蛋白质，内毒素，蛋白质突变体及蛋白质裂解物等。

4.1 外源性DNA

测定残留DNA的有效方法是DNA分子杂交技术。外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。DNA探针标记法有放射性同位素标记法、地高辛苷配基标记法。

4.2 宿主细胞蛋白质

宿主细胞蛋白质简称宿主蛋白，是指生产过程中来自宿主或培养基中的残留蛋白或多肽等杂质。为确保制品安全，必须测定制品中的宿主蛋白含量，一般采用ELISA法。也可采用western blot法作宿主蛋白的限度测定。

4.3 二聚体或多聚体的测定

一般采用分子排阻色谱法测定二聚体或多聚物的含量限度。二聚体或多聚物分子较单体分子量大一倍或数倍，因此进行色谱分析时，先于单体出峰。

4.4 降解产物的测定。

鉴于降解产物的基本结构与未降解的重组药物相似，因此，对降解产物的测定多采用离子对反相色谱法（reversed phase ion pair chromatography RPIC ) 。把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析的组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不荷电的中性离子，从而增加溶质与非极性固定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果。

5 结语

生物药物的质量分析需要综合运用理化、免疫学及生物学的分析方法才能完成。现代科学技术已提供了多种分析手段, 随着生物检测技术的不断发展, 相信还会有更多新技术应用到这个领域, 使该类药物的分析更加准确、简便。

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