紫外可见分光光度法基本原理

紫外可见分光光度法基本原理

透射比和吸光度

当一束平行光通过均匀的溶液介质时，光的一部分被吸收，一部分被器皿反射。设入射光强度为I0，吸收光强度为I a，透射光强度为I t，反射光强度为I r，则

在进行吸收光谱分析中，被测溶液和参比溶液是分别放在同样材料及厚度的两个吸收池中，让强度同为I0的单色光分别通过两个吸收池，用参比池调节仪器的零吸收点，再测量被测量溶液的透射光强度，所以反射光的影响可以从参比溶液中消除，则上式可简写为

透射光强度(I t)与入射光强度(I0)之比称为透射比(亦称透射率)，用T表示，则有:

溶液的T越大，表明它对光的吸收越弱；反之，T越小，表明它对光的吸收越强。为了更明确地表明溶液的吸光强弱与表达物理量的相应关系，常用吸光度(A)表示物质对光的吸收程度，其定义为:

则A值越大，表明物质对光吸收越强。T及A都是表示物质对光吸收程度的一种量度，透射比常以百分率表示，称为百分透射比，T％；吸光度A为一个无因次的量，两者可通过上式互相换算。

朗伯-比耳定律

朗伯-比耳定律(Lambert-Beer)是光吸收的基本定律，俗称光吸收定律，是分光光度法定量分析的依据和基础。当入射光波长一定时，溶液的吸光度A是吸光物质的浓度C及吸收介质厚度l(吸收光程)的函数。朗伯和比耳分别于1760年和1852年研究了这三者的定量关系。朗伯的结论是，当用适当波长的单色光照射一固定浓度的均匀溶液时，A与l成正比，其数学式为:

A = k＇l (此即称为朗伯定律，k＇为比例系数)

而比耳的结论是，当用适当波长的单色光照射一固定液层厚度的均匀溶液时，A与C成正比，其数学表达式为:

(此即称为比耳定律，k称为比例系数)

合并上述k的数值取决于吸光物质的特性外，其单位及数值还与C和l所采用的单位有关。l通常采用cm为单位，并用b表示。所以k的单位取决C采用的单位。

当C采用重量单位g/L时，吸收定律表达为:

(a称为吸光系数，单位为)

当C采用摩尔浓度mol/L时，吸收定律表达为:

(ε称摩尔吸光系数，单位为)

有时在化合物的组成不明的情况下，物质的摩尔质量不知道，因而物质的量浓度无法确定，就不能用摩尔吸光系数，而是采用比吸光系数，其意义是指质量分数为1％的溶液，用1cm吸收池时的吸光度，这时吸光度为:

(c的质量百分浓度)

ε、a、三者的换算关系为：

，(Mr为吸收物质的摩尔质量)

在吸收定律的几种表达式中，在分析上是最常用的，ε也是最常用的，有时吸收光谱的纵坐标也用ε或lgε表示，并以最大摩尔吸光系数表示物质的吸收强度。ε是在特定波长及外界条件下，吸光质点的一个特征常数，数值上等于吸光物质的浓度为1 mol/L，液层厚度为1cm时溶液的吸光度。它是物质吸光能力的量度，可作为定性分析的参考和估计定量分析的灵敏度。

朗伯比耳定律

朗伯－比耳定律的推导如下：根据量子理论，光是由光子所组成，其它能量为。因此，吸收光的过程就是光子被吸光质点(如分子或离子)的俘获，使吸光质点能量增加而处于激发状态，光子被俘获的几率取决于吸光质点的吸光截面积。如图1所示，

图1 辐射吸收示意图

如有一束强度为I o的单色平行光束，垂直通过一横截面积为S的均匀溶液介质。在吸收介质中，光的强度为I x(I x在光束通过介质的过程中，因光能量不断被吸收而逐渐变小)，当光束通过一个很薄的介质层db后，光强减弱了dI x，则厚度为db的吸收层对光的吸收率为

量子理论表明，光束强度可以看作是单位时间内流过光子的总数，于是可以看作是光束通过吸收介质是每个光子被吸光物质吸收的平均几率。另一方面，由于液层厚度db为无限小，所以在这个小体积单元中，所以吸光质点所占的吸收截面积之和dS与横截面

积S之比也可看作为该截面上光子被吸收物质吸收的几率。因此就有：

如果吸收介质中含有m种不同的吸光质点，而且它们之间没有相互影响，设a i为第I种吸光质点对指定波长的吸收截面积，dn i为第I种吸光质点在db小体积单元之中的数目，则

代入上式，则得到:

当光束通过液层厚度为b时，对上式两边积分，得到:

根据吸光度的定义，

截面积S是均匀介质的体积V与液层度b之比，即S=V/b，代入上式，得到

式中N A为阿佛加德罗常数。为第I种质点在均匀介质中的浓度C i，当V的单位为L 时，C i为摩尔浓度。将0.4343N A a i合并为常数，当C i为摩尔浓度时，该常数εi，则得到

上式表明，当一束平行单色光通过一个均匀吸收介质时，总吸光度等于吸收介质中各吸光物质吸光度之和，即吸光度具有加和性，这是进行多组分光度分析的理论基础。当吸收介质中只含有单一种吸收物质时，上式简化为

——朗伯－比耳定律的常用表达式

与测量仪器有关的因素

图2 分析谱带的选择

从理论上来说，朗伯－比耳定律上适用于单色光(即单一波长的光)，但是紫外－可见分光光度计从光源发出的连续光经单色器分光，为了满足实际测量中需要有足够光强的要求，入射光狭缝必须有一定的宽度。因此，由出射光狭缝投射到被测溶液的光束，并不是理论要求的严格单色光，而是由一小段波长范围的复合光，由分子吸收光谱是一种带状光谱，吸光物质对不同波长光的吸收能力不同，在峰值位置，吸收能力最强，ε最大，用表示，其他波长处ε都变小，因此当吸光物质吸收复合光时，表现吸光度要比理论吸光度偏低，因此

导致比耳定律的负偏离。在所使用的波长范围内，吸光物质的吸光系数变化越大，这种偏离就越显著。例如，按图2的吸收光谱，选择宽度作为入射光时，吸光系数变化较小，测量造成的偏离就比较小，若选择谱带Ⅱ的波长宽度作为入射光时，吸光系数的变化很大，测量造成的偏离也就很大。所以通常选择吸光物质的最大吸收波长(即吸收带峰所对应的波长)作为分析的测量波长，这样不仅保证有较高的测量灵敏度，而且此处的吸收曲线往往较为平坦，吸光系数变化比较小，比耳定律的偏离也比较小。对于比较尖锐的吸收带，在满足一定的灵敏度要求下，尽量避免用吸收峰的波长作为测量波长。投射被测溶液的光束单色性(即波长范围)越差，引起的比耳偏离也越大，所以，在保证足够的光强前提下，采用窄的入射光狭缝，以减小谱带宽度，降低比耳定律的偏离。

与样品溶液有关的因素

●当吸收物质在溶液中的浓度较高时，由于吸收质点之间的平均距离缩小，邻近质点彼此

的电荷分布会产生相互影响，以致于改变它们对特定辐射的吸收能力，即改变了吸光系数，导致比耳定律的偏离。通常只有当吸光物质的浓度小于0.01 mol/L 的稀溶液中，吸收定律才成立。

●推导吸收定律时，吸光度的加和性隐含着测定溶液中各组分之间没有相互作用的假设。

但实际上，随着浓度的增大，各组分之间甚至同组分的吸光质点之间的相互作用是不可避免的。例如，可以发生缔合、离解、光化学反应、互变异构及配合物配位数的变化等等，会使被测组分的吸收曲线发生明显的变化，吸收峰的位置、强度及光谱精细结构都会有所不同，从而破坏了原来的吸光度与浓度之间的函数关系，导致比耳定律的偏离。

●溶剂及介质条件对吸收光谱的影响十分重要。溶剂及介质条件(如pH值)经常会影响被

测物理的性质和组成，影响生色团的吸收波长和吸收强度，也会导致吸收定律的偏离。

●当测定溶液有胶体、乳状液或悬浮物质存在时，入射光通过溶液时，有一不忿光会因散

射而损失，造成“假吸收”，使吸光度偏大，导致比耳定律得正偏离。质点的散射强度与照射光波长的四次方成反比，所以在紫外光区测量时，散射光的影响更大。

●

此外，吸收定律的偏离还与溶液的折射率有关，摩尔吸光系数ε是真实摩尔吸光系数