糖化酶活力测定

3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液 5ml，缓慢加入0.1N NaOH溶液 5ml ，(注意： 加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧 化C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的 NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) 摇匀，在暗处 放置15min后加入1N硫酸2ml；
测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱 农法（ＳＰ法） 、Schoorl法（ＤＵ法）和 对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）等方法。 本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。糖 化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下进行 反应,反应生成得葡萄糖用次碘酸钠法定量测 定。以单位时间内分解α–１，４糖苷键生 成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。当酶 的反应条件不相同时,酶活力单位定义也有所 差别。糖化酶的最适pH范围是4～5,最适应温 度范围是50～60℃。
因此，1mol葡萄糖与1molI2 相当。
6.析出的;2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
没有葡萄糖的情况
1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O
2、NaIO在碱性条件下发生歧化反应:
3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 3、总反应
6.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
三、试剂与器材
1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角
瓶、pH计、电子天平； 3.试剂
2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1N碘液；0.1N氢氧化钠溶液； 1N硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5% 淀粉指示剂。
发生歧化反应:
3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 5.歧化产物在酸性条件下进一步作用生成I2:
NaIO3 +5NaI +6HCl=3I2 +6NaCl +3H2O
在这一系列的反应中，1mol葡萄糖与 1mol NaIO 作用，而1molI2 产生1molNaIO，
因此，1mol葡萄糖与1molI2 相当。
4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可）， 用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终 点。记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶 液样品（A）、空白对照（B）；
5.计算： (1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶 液生成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：
酶活力单位（U/ml）=
酶活力单位（U/ml）=
（B－A）×10-3 ×（N/2）×（8/5）×106×2 ×（1/10）
式中符号与前式相同。
五、实验报告
将重复3次测定的糖化酶活力结果记录在 实验报告中，并按提供的两种计算公式分 别计算出酶活力。
六、问题和思考
1.糖化酶的作用有何特点？ 2.次碘酸钠法的测定原理；你认为实验过程中
称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml。
（6）1mol/L硫酸溶液
量取浓硫酸5.6ml，慢慢加入于80 m1蒸馏水中，冷却后定容至l00ml，摇匀。
（7）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液
配制：称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)24.82g和碳酸钠约0.2g（硫代硫酸钠溶液 在pH9-10时最稳定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2），定容至1000ml，即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封保存，配制后应放置一星期标定使用。
称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.722，用蒸馏水溶解，定容至100m1。冰醋酸 (CH3COOH)1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度 计或精密试纸校正pH。
（3）20%氢氧化钠溶液 （4）0.1mol/L碘液 （5）0.1mo1/L氢氧化钠溶液
1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O
2.C6H12O6 与NaIO定量作用: C6H12O6 +NaIO =C6H12O7 + NaI
3.总反应:
I2 +C6H12O6 +2 NaOH=C6H12O7 +2 NaI+H2O 4. C6H12O6作用完后,剩下的NaIO在碱性条件下
酶活力单位（U/ml）= （B－A）×10-3 ×（N/2）产生的葡萄糖的量
×（8/5） ×106 转为umol ×2 酶液量0.5ml ×（1/10）转为1min
式中符号与前式相同。
（1）2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入
巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当天配制。 （2）0.2mol/L pH4.6醋酸钠缓冲液
四、操作步骤
1.取4个带塞的试管（3个作平行重复、1个作 空白对照），分别吸取2%可溶性淀粉液5ml， 加入pH4.6醋酸缓冲液2.5ml，混匀后于40 ℃ 水浴中预热10min。
2.加入酶液0.5ml（空白对照组以煮沸失活的酶 液代替）于40 ℃，反应10min；反应结束时， 立即于沸水浴加热5min使酶失活(此时应将 试管的塞子打开）。
（B－A）×（N/2）× 180.1×（8/5）×2
×（60/10）
式中: B- 空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数； A- 酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平
均值）； N- 硫代硫酸钠的当量浓度。
（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2%淀 粉溶液水解生成1μmol葡萄糖的酶量定义为1个 酶活力单位（U）：
3I2+6 NaOH =NaIO3+5NaI+3H2O 5.歧化产物在酸性条件下进一步作用生成I2:
NaIO3 +5NaI +3H2SO4=3I2 +3Na2SO4+3H2O
5.计算： (1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶 液生成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：
酶活力单位（U/ml）= （B－A）×（N/2）产生的葡萄糖的量
× 180.1 MG ×（8 样品总量8ml /5反应量5ml）
×2 酶液0.5ml ×（60/10） 反应时间10min 式中: B- 空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数； A- 酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平均值）； N- 硫代硫酸钠的当量浓度。
（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2%淀粉溶液 水解生成1μmol葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位 （U）：
哪些步骤关键，应注意些什么问题？
3.为什么用失活酶液作为空白对照而不用蒸馏 水？
4.两个计算糖化酶活力的公式中各项的意义及 两者各有何特点？
七、注意事项
1.注意安全; 2.滴定操作要规范、仔细准确; 3.认真完成实验报告； 4.实验完成以后须清扫整理才能离开。
在这一系列的反应中，1mol葡萄糖与 1mol NaIO 作用，而1molI2 产生1molNaIO，
实验三
糖化酶活力的测定
一、目的和内容
目的：掌握测定糖化酶活力的方法和学习测 定的原理
内容：１.测定糖化酶活力． ２.计算糖化酶活力．
二、基本原理
糖化酶（glucoamylase）又称淀粉葡萄糖苷 酶（系统名淀粉α–１，４葡萄糖苷酶，ＥＣ３. ２.１.３），是一种外切型淀粉酶，能从淀粉分 子非还原端依次水解α–１，４键切下葡萄糖单位。 也能水解麦芽糖和支链淀粉分支点的α–１，６键， 但水解速度甚慢。该酶能广泛用于酒精、酿酒、 葡萄糖及果 葡糖浆的制造上．糖化 酶是一种胞外酶，可利 用黑曲霉、海藻曲霉、 和根霉等生产。
次碘酸钠法
碘与NaOH作用能生成NaIO(次碘酸钠,弱氧 化剂),而C6H12O6 (葡萄糖)能定量地(1:1)被 NaIO氧化.在酸性条件下,未与C6H12O6 作用 的NaIO可转变成I2 析出,因此只要用Na2S2O3 标准溶液滴定析出的I2 ,便可计算出 C6H12O6 ,的含量.以上各步可用反应方程式 表示如下: