MLVA分型技术和实验操作步骤
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4
VNTR
• VNTR：可变数目出那里重复序列， Variable Number of Tandem Repeats •
重复单元
AACTTTACGTTC AAATTAACGTTC AAATTAACGTTC AAATTTACCTTG
侧 翼 序 列
5
18bp*3
• AACCTAAACAGACCATGGCGCTGGGC TGCTGGAGCGAGCAGGAGCTGGTGG GCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCA GGAGCTGGTGGGCGAGCAGGGA
• • • • 多位点可变数目串联重复序列分析 可变数目串联重复：VNTR： MLVA方法：即VNTR的数组 例如：
其他特征
MLVA1型别 菌株 血清型 TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 MLST
MLVA1型 735 MLVA14 1046
2 15
6 3
6
2 10 9
菌株名称 GZ1 P1/7 05ZYH33
血清型 2 2 2 2 2
来源 (CP000837) (www.sanger.ac.u k) (NC_009442) (NC_009443)
ST 型 ST1 ST1 ST7 ST7 ST7
• 以猪链球菌为例： • 鉴定了750,749,790,784 • 测序菌株基因组串联重复位点的比较
• 聚类分析 • 构建最小生成树
11
MLVA 实验操作
• • • • • • • • 一、模板制备：DNA提取模板或水煮模板 二、PCR 扩增 多重PCR反应 三、扩增条带大小判断： （一）毛细管电泳： 1.引物标记 2. 多种不同的荧光染料标记上游引物（FAM 、HEX 和TAMRA ） 3. ABI 3730系统进行分析， 用内标（ABI自带）
24
串联重复的鉴定
25
26
inserted a small segment
泳道 菌号
1 SC22
2 NJ25
3 9802
4 9801
5 GZ1
6 89-1591
7 P1/7
8 R735
9 ATCC43765
10 11611
11 HASS-73
12 SC061001
13 SC06238
14 06GZ1
2 1
3 2
3 3
1 0
36 26
ST1 ST81
+ + - - -
1.7 1
10
分析软件：BioNumerics
• 命名MLVA型：MT1-MT85
• 评价各位点的分辨力：
Nei’s index = 1-Σ (allele frequency)2 • 评价MLVA方法的分辨力： Simpson's index = 1 - Σ [nj (nj-1)]/[N (N-1)]
14
用毛细管电泳来判断片段大小 用500liz内标标定扩增片段大小用 genemap软件分析毛细管电泳图
15
MLVA聚类分析
• Bionumerics 软件（version 4.64 ）
• 效用均等的分类资料的分析方法 （ UPGMA） (unweighted pair group method
•
（二）普通电泳分析
•
（三）测序分析
12
模板制备： DNA提取模板 水煮模板
MLVA实验步骤-PCR
2个PCR体系/多重PCR体系：
指标 体系 （20ul） Buff er dNTP 上下游引 物 10uM（个 ul） 0.2 0.3 2.0 1.5 0.2 0.3 0.3u 0.7 57℃ 40秒 30 毛细管电泳 酶 模板ul Tm 延伸时 间 循环数 片段大小 判断方式
• 短期研究
– 了解病原菌的适应性 – 感染溯源
2
分子分型方法
• 序列或分类资料为基础的等位基因： • 多位点序列分析（multilocus sequence typing，MLST） • 多位点可变数目串联重复序列分析（Multiple-Locus Variable-number tandem-repeat Analysis,MLVA） • • 图像分析： • 脉冲场凝胶电泳（PFGE) • 随机扩增多态性DNA分析（random amplified polymorphic DNA，RAPD) • 扩增片断长度多态性分析（amplified fragment length polymorphism, AFLP） • 核糖体分型（ribotyping） • 等
17
分型方法评价标准
• • • • • • • • • • • 区分度(discriminatory power) 数字化数据库 适合实验室间比对（compare between laboratories） 重复性（Reproducible） 流行病学相关性（epidemiological concordance） 方便快速（convenience and rapidity ） 稳定性（stability） 容易解释（easy to interpret） 花费 技术难度
100 bp
VNTR和等位基因
下游序列
VNTR 重复 Primer-F
atgggtaatccgtcgACGCACGCACGCgccaatcgatacgat
上游序列 Primer-R
重复拷贝数 =
扩增大小-上下游序列 重复单元的大小
取整：就近取整或去除小数取整
8
串联重复序列可变重复数目的判定
9
MLVA方法
A1
TR2-FAM TR4-HEX
2.0
1.5
0.3u
0.7
56℃
40秒
30
毛细管电泳
A2
TR1- FAM TR3-HEX
13
扩增条带大小判断：
• （一）毛细管电泳： • 1.引物标记 • 2. 多种不同的荧光染料标记上游引物 （FAM 、HEX 和TAMRA ） • 3. ABI 3730系统进行分析， 用内标 （ABI自带） • （二）普通电泳分析 • （三）测序分析
217185--217309
12
9.7
12
58
14
87
27
16
34
21
1.95
29
第三部分
MLVA方法在猪链球菌分型中的应用
30
猪链球菌暴发疫情
• 2005年-四川人感染猪 链球菌暴发疫情 • 215人感染、39人死亡 • 波及四川36个县的202 个村庄 • 重庆， 贵州， 广东， 江西也发现病例
15
16
17
18
1920ຫໍສະໝຸດ 212223
24
LN1
GX2
CQ1
GZ2
SC17
SC84
4380032
4380026
RC4716
Gx407
27
28
多种重复模式
TR2
Indices 217182--217298 217182--217291 217221--217313 Period Size 24 15 39 Copy Number 4.5 8.1 2.4 Consensus Size 24 14 39 Percent Matches 61 57 94 Percent Indels 18 18 1 Score 96 77 171 A 27 27 25 C 16 17 16 G 35 35 34 T 21 20 23 Entropy (0-2) 1.94 1.94 1.95
Tandem repeat sequence
CGTTAAGCAAATCCTAGACAAAATAGGAAATCGAAGCAGATAGCTTCAATCAAGGAGATTT ATCTTTTTGCCAGAATTTGTAGCTCGAATTCAACTAAGATTAAGATAGAGGA AGCAGCCTGTAGTTGAGGCACCTGTAGAGGAAGTTGTAG CAAGAAAAAATGGTCCATTCTCGCCGTTGCGCCTTTCCAGTTTCTTGGGCG ATATTGAAACCTCTGAAAAACAGATGCCAAGTATTGTGAACGACAATGTCGTAACACCTGA AAAGCAAATGGCTAATAAAGAGAACGATA AAGGTCCGGTGGACCTTTTTATCATGAGCATGAAAACAAGAAAGCGAATT CGTTGCTGGTACCGTAGCAGTTGCATCAGT AAAATATAGA CCAGAAGAGCCAAAACAAGACGCTCCACAAGCGCCATCAACACCGGAAAAACAAACAGAA GAACCGAACAAGGAAGAACCTAAGAAAACACCACAAGCGCCATCGACTCCGGAA AAACAACCAGAAGTACCGGAATCACCAAACCCAGAGACACCAGACGCGCCATCGA CTCCAAAAGATGAACCGCAAGCTCCATCAATCCCAGAAGAAAAACCAAAAGTA GAGCA
多位点可变数目串联重复序列 （MLVA）分型技术和操作步骤
李 伟
中国CDC 传染病所 传染病预防控制国家重点实验室 PulseNet China第一期培训 2010-06-19
1
病原菌分子分型的目的
• 长期研究 病原菌的遗传进化
– 病原菌适应来自宿主的高选择性压力 – 因点突变、重组（包括基因转移）等遗传变异
98HAH12 SC84
22
串联重复的鉴定
23
串联重复的鉴定
Indices 1858865--1858900 1862974--1863158 1867321--1867363 Period Size 12 46 16 Copy Number 3.0 3.9 2.6 Consensus Size 12 46 16 Percent Matches 70 78 70 Percent Indels 0 4 7 Score 52 228 52 A 36 22 25 C 5 23 25 G 33 12 13 T 25 40 34 Entropy (0-2) 1.79 1.89 1.93
VNTR产生的原因：聚合酶的滑链复制
6
VNTR 位点的确定
TRF 软件（Tandem Repeats Finder software）， ://minisatellites.u-psud.fr/
Strain H37Rv: 4 x 15 bp Strain CDC1551: 5 x 15 bp
215 bp
• SmaI酶切：ST7型分为单一的PFGE-01型 • 2005，2006年和2007年中国ST7菌株： PFGE-01型
Ye, et al. 2006. Emerg.Infect.Dis.
32
猪链球菌MLVA指标和特征
cod e Location in GZ1 Locus§ Matches In GZ1 % Tm℃
• 江苏 1998暴发疫情 • 25 感染/14 死亡
Yu, H., H. Jing, Z. Chen, et al. 2006. Human Streptococcus suis outbreak, 四川, China. Emerg.Infect.Dis. 12:914-920
31
中国猪链球菌PFGE型别
18
MLVA方法的好处
• 上述的优点
• 具有弹性 flexibility. • 不需要参考菌株作为参照
19
第二部分
发展一种新的MLVA方法
20
系统测试筛选多态性VNTR
基于序列的比较 初筛 得分大于70，拷贝数大于3，同源性大于75% 选择出114位点
多态性VNTR位点的 PCR鉴定和筛选
现实的模板扩筛选 33血清型和21个猪链球菌2型 36个电泳行为不同
PCR primers:
CTCCCACACCCAGGACAC PCR CGGCCTACCCAACATTCC
230 bp
strain H37Rv : 215 bp
300 bp 200 bp
Gel migration
strain CDC1551 : 230 bp
测序分析
230 bp 215 bp 200 bp 7
核酸测序 确定重复模式
确认重复序列和重复单元数 14个确定指标
区分效能评价
9个指标的MLVA策略
21
串联重复的鉴定
TRF 软件
（Tandem Repeats Finder software）
://minisatellites.u-psud.fr/
• • • • 匹配赋2分 不匹配-3分 碱基缺失-5分 最小报告分值50分
3
MLST
• 结果无偏性unambiguous results • 有相应的数据库支持 international databases
• 区分度低，Low discrimination power • 高花费，high cost: sequencing • 不适合常规检测和暴发调查，unsuitable for routine surveillance and epidemiological studies
using arithmetic averages)
• 等分权重 • 分类图/最小生成树的形式展现 • 多态性指数： Simpson’s index
16
MLVA方法的应用
• • • • • • • • • • • • • • Neisseria meningitidis(23) Streptococcus pneumoniae(20), Streptococcus uberis(12), Salmonella Enteritidis(10), Salmonella enterica(5,35), Listeria monocytogenes(28,29,39), Legionella pneumophila(33), Clostridium perfringens(37), Leptospira interrogan(38,38), Escherichia coli O157:H7(30,46), Clostridium difficile(43), Burkholderia pseudomallei(42), Pseudomonas aeruginosa(32), Shigella spp(13) et.al..
VNTR
• VNTR：可变数目出那里重复序列， Variable Number of Tandem Repeats •
重复单元
AACTTTACGTTC AAATTAACGTTC AAATTAACGTTC AAATTTACCTTG
侧 翼 序 列
5
18bp*3
• AACCTAAACAGACCATGGCGCTGGGC TGCTGGAGCGAGCAGGAGCTGGTGG GCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCA GGAGCTGGTGGGCGAGCAGGGA
• • • • 多位点可变数目串联重复序列分析 可变数目串联重复：VNTR： MLVA方法：即VNTR的数组 例如：
其他特征
MLVA1型别 菌株 血清型 TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 MLST
MLVA1型 735 MLVA14 1046
2 15
6 3
6
2 10 9
菌株名称 GZ1 P1/7 05ZYH33
血清型 2 2 2 2 2
来源 (CP000837) (www.sanger.ac.u k) (NC_009442) (NC_009443)
ST 型 ST1 ST1 ST7 ST7 ST7
• 以猪链球菌为例： • 鉴定了750,749,790,784 • 测序菌株基因组串联重复位点的比较
• 聚类分析 • 构建最小生成树
11
MLVA 实验操作
• • • • • • • • 一、模板制备：DNA提取模板或水煮模板 二、PCR 扩增 多重PCR反应 三、扩增条带大小判断： （一）毛细管电泳： 1.引物标记 2. 多种不同的荧光染料标记上游引物（FAM 、HEX 和TAMRA ） 3. ABI 3730系统进行分析， 用内标（ABI自带）
24
串联重复的鉴定
25
26
inserted a small segment
泳道 菌号
1 SC22
2 NJ25
3 9802
4 9801
5 GZ1
6 89-1591
7 P1/7
8 R735
9 ATCC43765
10 11611
11 HASS-73
12 SC061001
13 SC06238
14 06GZ1
2 1
3 2
3 3
1 0
36 26
ST1 ST81
+ + - - -
1.7 1
10
分析软件：BioNumerics
• 命名MLVA型：MT1-MT85
• 评价各位点的分辨力：
Nei’s index = 1-Σ (allele frequency)2 • 评价MLVA方法的分辨力： Simpson's index = 1 - Σ [nj (nj-1)]/[N (N-1)]
14
用毛细管电泳来判断片段大小 用500liz内标标定扩增片段大小用 genemap软件分析毛细管电泳图
15
MLVA聚类分析
• Bionumerics 软件（version 4.64 ）
• 效用均等的分类资料的分析方法 （ UPGMA） (unweighted pair group method
•
（二）普通电泳分析
•
（三）测序分析
12
模板制备： DNA提取模板 水煮模板
MLVA实验步骤-PCR
2个PCR体系/多重PCR体系：
指标 体系 （20ul） Buff er dNTP 上下游引 物 10uM（个 ul） 0.2 0.3 2.0 1.5 0.2 0.3 0.3u 0.7 57℃ 40秒 30 毛细管电泳 酶 模板ul Tm 延伸时 间 循环数 片段大小 判断方式
• 短期研究
– 了解病原菌的适应性 – 感染溯源
2
分子分型方法
• 序列或分类资料为基础的等位基因： • 多位点序列分析（multilocus sequence typing，MLST） • 多位点可变数目串联重复序列分析（Multiple-Locus Variable-number tandem-repeat Analysis,MLVA） • • 图像分析： • 脉冲场凝胶电泳（PFGE) • 随机扩增多态性DNA分析（random amplified polymorphic DNA，RAPD) • 扩增片断长度多态性分析（amplified fragment length polymorphism, AFLP） • 核糖体分型（ribotyping） • 等
17
分型方法评价标准
• • • • • • • • • • • 区分度(discriminatory power) 数字化数据库 适合实验室间比对（compare between laboratories） 重复性（Reproducible） 流行病学相关性（epidemiological concordance） 方便快速（convenience and rapidity ） 稳定性（stability） 容易解释（easy to interpret） 花费 技术难度
100 bp
VNTR和等位基因
下游序列
VNTR 重复 Primer-F
atgggtaatccgtcgACGCACGCACGCgccaatcgatacgat
上游序列 Primer-R
重复拷贝数 =
扩增大小-上下游序列 重复单元的大小
取整：就近取整或去除小数取整
8
串联重复序列可变重复数目的判定
9
MLVA方法
A1
TR2-FAM TR4-HEX
2.0
1.5
0.3u
0.7
56℃
40秒
30
毛细管电泳
A2
TR1- FAM TR3-HEX
13
扩增条带大小判断：
• （一）毛细管电泳： • 1.引物标记 • 2. 多种不同的荧光染料标记上游引物 （FAM 、HEX 和TAMRA ） • 3. ABI 3730系统进行分析， 用内标 （ABI自带） • （二）普通电泳分析 • （三）测序分析
217185--217309
12
9.7
12
58
14
87
27
16
34
21
1.95
29
第三部分
MLVA方法在猪链球菌分型中的应用
30
猪链球菌暴发疫情
• 2005年-四川人感染猪 链球菌暴发疫情 • 215人感染、39人死亡 • 波及四川36个县的202 个村庄 • 重庆， 贵州， 广东， 江西也发现病例
15
16
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1920ຫໍສະໝຸດ 212223
24
LN1
GX2
CQ1
GZ2
SC17
SC84
4380032
4380026
RC4716
Gx407
27
28
多种重复模式
TR2
Indices 217182--217298 217182--217291 217221--217313 Period Size 24 15 39 Copy Number 4.5 8.1 2.4 Consensus Size 24 14 39 Percent Matches 61 57 94 Percent Indels 18 18 1 Score 96 77 171 A 27 27 25 C 16 17 16 G 35 35 34 T 21 20 23 Entropy (0-2) 1.94 1.94 1.95
Tandem repeat sequence
CGTTAAGCAAATCCTAGACAAAATAGGAAATCGAAGCAGATAGCTTCAATCAAGGAGATTT ATCTTTTTGCCAGAATTTGTAGCTCGAATTCAACTAAGATTAAGATAGAGGA AGCAGCCTGTAGTTGAGGCACCTGTAGAGGAAGTTGTAG CAAGAAAAAATGGTCCATTCTCGCCGTTGCGCCTTTCCAGTTTCTTGGGCG ATATTGAAACCTCTGAAAAACAGATGCCAAGTATTGTGAACGACAATGTCGTAACACCTGA AAAGCAAATGGCTAATAAAGAGAACGATA AAGGTCCGGTGGACCTTTTTATCATGAGCATGAAAACAAGAAAGCGAATT CGTTGCTGGTACCGTAGCAGTTGCATCAGT AAAATATAGA CCAGAAGAGCCAAAACAAGACGCTCCACAAGCGCCATCAACACCGGAAAAACAAACAGAA GAACCGAACAAGGAAGAACCTAAGAAAACACCACAAGCGCCATCGACTCCGGAA AAACAACCAGAAGTACCGGAATCACCAAACCCAGAGACACCAGACGCGCCATCGA CTCCAAAAGATGAACCGCAAGCTCCATCAATCCCAGAAGAAAAACCAAAAGTA GAGCA
多位点可变数目串联重复序列 （MLVA）分型技术和操作步骤
李 伟
中国CDC 传染病所 传染病预防控制国家重点实验室 PulseNet China第一期培训 2010-06-19
1
病原菌分子分型的目的
• 长期研究 病原菌的遗传进化
– 病原菌适应来自宿主的高选择性压力 – 因点突变、重组（包括基因转移）等遗传变异
98HAH12 SC84
22
串联重复的鉴定
23
串联重复的鉴定
Indices 1858865--1858900 1862974--1863158 1867321--1867363 Period Size 12 46 16 Copy Number 3.0 3.9 2.6 Consensus Size 12 46 16 Percent Matches 70 78 70 Percent Indels 0 4 7 Score 52 228 52 A 36 22 25 C 5 23 25 G 33 12 13 T 25 40 34 Entropy (0-2) 1.79 1.89 1.93
VNTR产生的原因：聚合酶的滑链复制
6
VNTR 位点的确定
TRF 软件（Tandem Repeats Finder software）， ://minisatellites.u-psud.fr/
Strain H37Rv: 4 x 15 bp Strain CDC1551: 5 x 15 bp
215 bp
• SmaI酶切：ST7型分为单一的PFGE-01型 • 2005，2006年和2007年中国ST7菌株： PFGE-01型
Ye, et al. 2006. Emerg.Infect.Dis.
32
猪链球菌MLVA指标和特征
cod e Location in GZ1 Locus§ Matches In GZ1 % Tm℃
• 江苏 1998暴发疫情 • 25 感染/14 死亡
Yu, H., H. Jing, Z. Chen, et al. 2006. Human Streptococcus suis outbreak, 四川, China. Emerg.Infect.Dis. 12:914-920
31
中国猪链球菌PFGE型别
18
MLVA方法的好处
• 上述的优点
• 具有弹性 flexibility. • 不需要参考菌株作为参照
19
第二部分
发展一种新的MLVA方法
20
系统测试筛选多态性VNTR
基于序列的比较 初筛 得分大于70，拷贝数大于3，同源性大于75% 选择出114位点
多态性VNTR位点的 PCR鉴定和筛选
现实的模板扩筛选 33血清型和21个猪链球菌2型 36个电泳行为不同
PCR primers:
CTCCCACACCCAGGACAC PCR CGGCCTACCCAACATTCC
230 bp
strain H37Rv : 215 bp
300 bp 200 bp
Gel migration
strain CDC1551 : 230 bp
测序分析
230 bp 215 bp 200 bp 7
核酸测序 确定重复模式
确认重复序列和重复单元数 14个确定指标
区分效能评价
9个指标的MLVA策略
21
串联重复的鉴定
TRF 软件
（Tandem Repeats Finder software）
://minisatellites.u-psud.fr/
• • • • 匹配赋2分 不匹配-3分 碱基缺失-5分 最小报告分值50分
3
MLST
• 结果无偏性unambiguous results • 有相应的数据库支持 international databases
• 区分度低，Low discrimination power • 高花费，high cost: sequencing • 不适合常规检测和暴发调查，unsuitable for routine surveillance and epidemiological studies
using arithmetic averages)
• 等分权重 • 分类图/最小生成树的形式展现 • 多态性指数： Simpson’s index
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MLVA方法的应用
• • • • • • • • • • • • • • Neisseria meningitidis(23) Streptococcus pneumoniae(20), Streptococcus uberis(12), Salmonella Enteritidis(10), Salmonella enterica(5,35), Listeria monocytogenes(28,29,39), Legionella pneumophila(33), Clostridium perfringens(37), Leptospira interrogan(38,38), Escherichia coli O157:H7(30,46), Clostridium difficile(43), Burkholderia pseudomallei(42), Pseudomonas aeruginosa(32), Shigella spp(13) et.al..