实验1：大肠杆菌的培养和分离

养基
天然培养基
(根据用途)：
全营养培养基：含有微生物生长所需各种营养，
用于微生物生长和增殖
选择培养基：添加或减少某种成分，从多种微
生物中分离出所需的微生物
鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，鉴
定是否含有所要测定的微生物
一、基础知识
（二）培养基： 2、培养基的营养成分：
种 类 查氏培养基 成 分 NaNO3 0.3g 、 KCl 0.05g 、 K2HPO4 0.1g 、 FeSO4 0.001g 、MgSO4•7H2O 0.05g、蔗糖 3g 、 H2O 100g
麦芽汁培养基
干麦芽粉加四倍水
一、基础知识
（二）培养基： 供微生物等生长繁殖所需的人工配制的营养
液体培养基 1、分类(按物理状态)： 半固体培养基 固体培养基
60~80℃烘 箱中烘干
•操作步骤： 加塞封口、包扎 —— 灭菌 ——烘干
•通常试管用棉塞(2/3在试管 内)，三角瓶用封口膜或纱布。 •作用：既通气又阻止杂菌进 入 •不能用脱脂棉(易吸水引起污 染)。 用牛 皮纸 或报 纸包 扎 •放入高压蒸汽灭菌锅, 在121℃(1Kg/cm2压 力)下灭菌15min。 •培养基中若有葡萄糖, 用500g/cm2压力(90 ℃以上)灭菌30min。 防止葡萄糖分解碳化 •不能加热灭菌的化合 物(如尿素)，只能用 G6玻璃砂漏斗过滤。 细菌不能滤过G6
灼烧灭菌 干热灭菌 高压蒸汽灭菌
灼烧灭菌
用于接种工具(接 种环、接种针)或 其他金属用具。
干热灭菌
160－170℃；1－2h 用于能耐高温的需要保持干燥 的物品(如玻璃器皿)。
高压蒸汽灭菌
121℃(1Kg/cm2压力)；15min 最常用。通常用于培养基及各种 器具的灭菌。
培养基及器具的灭菌
根据细菌细胞壁成分的不同，通过革兰氏染色可 分为阳性和阴性两类
一、基础知识
（二）培养基： 供微生物等生长繁殖所需的人工配制的营养
液体培养基 1、分类(按物理状态)： 半固体培养基 固体培养基 •区别：是否加琼脂
液体培养基：微生物的扩大培养、工业生产 •用途： 半固体培养基：观察微生物的运动、鉴定菌种 固体培养基：微生物分离、鉴定、计数、保藏菌种 单个细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼 可见的，具有一定形态结构的子细胞群体——菌落 基质。
2、在作第二次以及其后的划线操作时，为什么要从 上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处 要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌 的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能 得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 3、为什么平板划线时不能划破培养基表面？ • 一是一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分 离单菌落的目的； • 二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌 落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的 菌落。
①梯度稀释
•用移液管吸1mL菌液和9mL无 菌水混合，梯度稀释 •移液管要灭菌，操作在火焰旁
②涂布分离
0.1ml
二、实验操作
（四）实验步骤： 5、菌种的纯化与保藏：
倒平板过程
1、无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒 精棉球消毒。
2、在火焰旁，右手无名指和 小指夹住封口膜，另外三指 拿三角瓶，并使三角瓶的瓶 口迅速通过火焰； 3、左手拿培养皿并打开上盖 的一边(不能全部打开)。 4、将三角瓶中的培养基倒入 培养皿，立刻盖上培养皿盖， 5、待平板冷却凝固后，将平 置于水平位置上，并轻轻晃动， 板倒过来放置。 使培养基铺满底部。
二、实验内容
（四）实验步骤： 4、大肠杆菌的分离：
•分离方法： 划线分离法和涂布分离法
•目的： 使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，并在 培养基表面形成单个细胞繁殖而成的子细胞群 体——菌落 •分离标准： 出现不连续的单个菌落 •单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是 用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。 •两种分离方法的优缺点： •划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。 •涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。
培养基成分
成分 碳源 主要作用 作能源物质 主要来源 无机碳(CO2 、 NaHCO3) 或有机碳(糖类) N2、NH3、铵、硝酸盐、 尿素、牛肉膏、蛋白胨
氮源 无机盐
水 生长因子
合成含N类化合物 调节渗透压等
溶剂，生化反应的介质 酶和核酸的组成成分
维生素、氨基酸、碱基
注意：
1、不同生物所需营养物质(即维持机体生命活动，保 证生长发育、生殖所需的外源物质)不同： 动物：包括水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、 维生素六类； 植物：包括矿质元素、水、二氧化碳三类； 微生物：包括水、无机盐、碳源、氮源及生长因 子五类。 2、微生物需要补充生长因子是由于缺乏合成这些物质 所需要的酶或合成能力有限。
1、大肠杆菌的外形： —— 杆状菌
细菌形态
A.球菌
B.杆菌
C.弧菌
2、大肠杆菌的代谢类型： —— 异养兼性厌氧菌
根据细菌所利用的碳源的不同，可分为两大营养 类型——自养菌和异养菌 根据细菌其生命活动过程中是否需要氧气，可分 为——需氧菌、厌氧菌和兼性厌氧菌
3、大肠杆菌的革兰氏染色： —— 革兰氏阴性菌
二、实验内容
（四）实验步骤： 3、大肠杆菌的扩大培养：
•过程： 1、接种环烧灼；
2、接种环在菌种斜面培养基上冷却； 3、挑取少许菌种接种到灭菌后的液体培养基中； 4、37℃摇床(每分钟200转)震荡培养12h
•注意事项：
1、取菌前接种环要用酒精灯 灼烧灭菌，冷却后方能取菌； 2、在火焰旁从斜面上用接种 环取菌； 3、接种后封口膜和棉塞复原
• 第一次灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在 的微生物污染培养物。 • 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束 后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接 种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而 通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目 逐渐减少，以便得到单菌落。 • 划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残 留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
二、实验内容
（一）实验目的：
1、进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培 养的操作。
2、进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌 的划线培养。 3、说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。
本实验的内容是：将大肠杆菌扩大培养和划线分离。
二、实验内容
（二）设备及用品：
（三）材料
1. 50mlLB液体培养基 ——用于大肠杆菌的扩大培养 2. 大肠杆菌菌种斜面 ——扩大培养所用菌种 3. 空白斜面 ——用于大肠杆菌的菌种保存
涂布分离法
•含义： 是指先将培养的菌液稀释一定的倍数，然后取一定
量稀释液(0.1ml)加在固体培养基上，用玻璃刮刀 涂布在培养基平面上。
•操作方法： •注意事项：
1、稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管均需 灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处。 2、涂布平板时： ①涂布器用70%酒精消毒，取出时，多余酒精在烧杯中 滴尽，沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃。 ②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引 燃其中的酒精。 ③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管头不要接触任何 物体。
实验1：大肠杆菌的培养和分离
一、基础知识
（一）微生物：
1、特点：结构简单，形体微小的单细胞、多细胞或没有
细胞结构的低等生物。通常要用光学显微镜或 电子显微镜才能看到。
病毒界 原核生物界 细菌、放线菌、蓝藻 …… 2、包括： 原生生物界 单细胞藻类、原生动物 …… 真菌界 酵母菌、霉菌 ……
3、大肠杆菌的常识：
不同的细菌的菌落特征不同；菌落是鉴定菌种的重要依据。
一、基础知识
（二）培养基： 供微生物等生长繁殖所需的人工配制的营养
液体培养基 1、分类(按物理状态)： 半固体培养基 固体培养基
基质。
(根据化学成分)： 合成培养基
天然培养基
•区别：成分是否明确 •用途： 合成培养基：一般用于分类、鉴定（实验室） 天然培养基：常用于工业生产
•自养微生物：无机碳源 •异养微生物：有机碳源
• 一般都要含有水、碳源、氮源、无机盐、生长因子 等营养物质；但各种培养基的具体配方不同。
细菌喜荤——要用蛋白胨和酵母提取物配制 霉菌喜素——常用无机物或添加蔗糖的豆芽汁配制
• 不同培养基还需要满足不同微生物对pH 、氧气、 渗透压等的要求。
细菌需加入一定量 NaCl来维持渗透压 细菌：中性偏碱 霉菌：中性偏酸 厌氧微生物需 提供无氧条件
一、基础知识
（三）无菌技术： 成功培养微生物的关键。 1、概念：泛指在培养微生物的操作中，所有防止外来
杂菌污染的方法。
2、具体操作：
•对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒； •将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；
•为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火 焰旁进行； •操作时应避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
二、实验内容
（四）实验步骤： 2、倒平板：
•含义：灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入培养皿中，置 •过程： •注意事项：
于水平位置上，并轻轻晃动，使培养基铺满底部， 待凝固后即形成平面。
1、灭菌后需待灭菌锅压力与大气压相同时才能打开锅盖， 培养基需要冷却到 60℃左右时，才能用来倒平板。 2、要使三角瓶的瓶口通过火焰的原因：通过灼烧灭菌，防 止瓶口的微生物污染培养基。 3、整个操作要在酒精灯火焰旁进行原因：避免杂菌污染。 4、平板冷凝后要倒置原因：既可使培养基表面的水分更好 地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。
二、实验内容
（四）实验步骤： 1、LB培养基的配制和灭菌：
•用途： LB液体培养基——细菌的扩大培养
LB固体培养基——细菌的划线分离
•配方：
培养基组分
提供的主要营养 氮源、碳源
富含小分子 蛋白胨 0.5g 氨基酸、多 酵母提取物 0.25g 肽、核苷酸、 氯化钠 0.5g 维生素等天 水 50mL 然活性成分 的物质 （琼脂 1g）
思考
灼烧接种环
灼烧接种环 灼烧接种环 灼烧接种环 灼烧接种环
冷却
蘸取菌液 冷却 冷却 冷却
划线(第一区域) 划线(第二区域) 划线(第三区域) 划线(第四区域)
平板倒置放置培养(37℃ ，12-24h)
单 菌 落
思考：
1、第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环，划线 操作结束仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的是什么？
3、消毒与灭菌的区别：
消毒与灭菌的区别
成分 消毒 使用较为温和的物理或化学方法， 仅杀死物体表面或内部一部分对人 体有害的微生物（不包括芽孢和孢 子）。 灭菌 使用强烈的理化因 素，杀死物体内外 所有的微生物，包 括芽孢和孢子。
概念
煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min 巴氏消毒法：常用于牛奶的消毒 （70-75 ℃下煮30min或 80 ℃下 常用 煮15min） 方法 化学药剂消毒：如用70%酒精进行 皮肤消毒，氯气消毒水源 紫外线消毒：用于空气消毒
生长因子 无机盐（维持渗透压） (溶剂，生化反应的介质) （凝固剂）
•操作步骤： 称量——溶化——调PH——分装——加塞
封口、包扎——灭菌(有压力后开始计时)
分装
•液体分装到三角瓶，一般培养液高度不超过瓶高1/4。 •固体分装到试管，培养液应不超过管高1/5 。 ——便于放斜面 增大表面积，主要培养接 种用菌种及菌种的保存。 •分装过程中培养基不能沾上管口或瓶口，在将培养基 分装到三角瓶或试管中时必须用三角漏斗。 ——以免引起污染 本实验是将50mlLB液体培养基和 50mlLB固体培养基(刚配好，尚未凝 固)分别装入2个250ml的三角瓶中。
本实验采用的是划线分离法
划线分离法
•含义： 通过接种环在固体培养基表面划线的操作，将聚集
的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。 肉眼可见的子细胞群体，即菌落。
•原理： 在数次划线后，可以分离到由一个细胞繁殖而来的 •操作方法：交叉划线法和连续划线法 •注意事项：
1、接种环只蘸一次菌液。 2、每次划线之前接种环都需灼烧灭菌，划线操作结束仍 需灼烧接种环。 3、灼烧的接种环要冷却后才能伸入菌液，以免温度太 高杀死菌种。 4、划线时最后一区域不要与第一区域相连。 5、画线用力大小要适当，防止将培养基划破。