第8章分离分析法导论

（2）分离度与分配比的关系
k增大可使R增大，当k >10时，k/k＋1改变不大，R增长是不大， 一般取k为1~10最宜。 改变柱温和相比，可以改变k。
（3）分离度与相对保留值的关系
r2,1= 1时，R = 0，不能使两组分分离。 r2,1>1才可进行分离。 r2,1大，选 择性好。 r2,1的微小变化，就能引起分离度的显著变化。
（5）色谱柱中没有真正的平衡体系
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2、速率理论
1956年，荷兰，范弟姆特，速率理论
B H A Cu u
A：涡流扩散项系数，B：分子扩散项系数，
C：传质项系数，u：平均流速
A，B，C越小，H越小，n越大，柱效高
A，B，C越大，H越大，n越小，柱效低
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B/u-分子扩散项（纵向扩散项）
样品在纵向上的浓度梯度而造成的扩散
B 2Dg

影响因素： ：弯曲因子。填充柱中由于固定相颗粒的存在，使分子自由扩散受 到阻碍，扩散程度降低，<1；空心毛细管柱=1。 Dg：组分分子在其气相中的扩散系数。组分分子量大，柱温高， 柱 压大， 载气分子量大， Dg小；反之则大。 u：流动相平均线速，纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关，流 动相流速小，组分停留时间长，纵向扩散就大。 结论： 采用分子量较大的载气，较高的载气流速，控制较低的温度，可使 分子扩散项系数减小
dp 0.01k Cm ' 2 (1 k ) Dg
'2
影响因素：容量因子k’ ，填充物平均直径dp，组分在气相中的扩散系数 Dg 结论：采用颗粒小的填充物，及分子量小的载气

Cs：固定相传质阻力项系数，组分分子由流动相进入固定相内部，达到分配 平衡，又回到界面，再溢出界面，被流动相带走这一过程受到的阻力
(a) 两组分没有完全分离 (b) 两组分完全分离，但柱效不高 (c) 两组分分离不完全，但柱效较好
(d) 两组分分离完全，且柱效很好
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分离度
分离度概念：又叫分辨率或分辨度，色谱峰中相邻两峰分离程度的量 度，是相邻两峰保留值之差与两峰峰底宽的平均值之比。
t R ( 2) t R (1) R 1 (Y1 Y2 ) 2
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二、色谱分析法基本理论
A,B组分未分离

A,B组分分离不完全
A,B组分分离完全

两组分的分配系数有差异 区域扩散速率小于区域分离速率 受哪些因素影响？

塔板理论 速率理论
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1、塔板理论
假设： （1）色谱由一系列连续的，相等的水平塔板组成， 每一塔板高度为H，理论塔板数n=L/H （2）在每一塔板内，组分可在两相间迅速达到平衡 （3）流动相进入是间歇的，而非连续，每次进入为一个塔板体积 （4）所有组分开始存在于0号塔板上，而且试样沿纵向扩散不计 （5）分配系数K恒定不变 结论：
n有效 r2,1 1 4 r2,1
2
Байду номын сангаасr2,1
n有效 16 R (
r2,1 r2,1 1
)2
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（1）分离度与柱效的关系
1 k' n r2,1 仪器分析 R ' 4 r2,1 k 1
n越大，R越大——n=L/H， (R1/R2)2 = n1/n2 = L1/L2 增加柱长的色谱柱可以提高分离度，但延长了分析时间。 制备一根性能优良的柱子，通过降低板高，以提高分离度。
1948, 8 days separation for 16 amino acids
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Developing of Chromatographic Technique
1958, 22 hours separation for 19 of amino acids
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总的影响因素：填充物的均匀程度，填充物粒度的大小，流动相的种类 和线速，固定相的液膜厚度
B H A Cu u
B B Cu 2 Cu 2 BC u u
H最小 =A+2 BC
B u最佳 = C
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3、色谱分离效能的衡量

柱效：色谱分离的动力学因素，由理论塔板数来衡量。如果若tR 一定，那么n越大，H越小，则色谱峰越窄，柱效能越高。 选择性：两峰间的距离衡量色谱的选择性，距离越大选择性越好， 一般以表示
Y0.15 Y0.85 A 1.065h （非对称峰） 2
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仪器分析 ③保留值：表示试样中各组分在色谱柱内停留状况的指标，反映组分分子与 固定相分子间作用力的大小，通常用时间和流动相的体积表示。 用时间表示的保留值（单位：min，s等） 死时间（t0）：不被固定相保留的组分，从进样到出现最大峰所 需的时间，也即流动相流经色谱柱所需的时间 L t 保留时间（tR）：试样从进样到出现最大峰所需的时间 0 u 调整保留时间（tR’）：tR’=tR-t0 用体积表示的保留值（单位：mL） 死体积（V0）：不被固定相保留的组分，通过色谱柱所消耗的流动相 体积，由死时间确定 保留体积（VR）：试样从进样到出现最大峰所通过的流动相体积 调整保留体积（VR’）：VR’=VR-V0 相对保留值（2,1）：也称选择性因子，为两组分的调整保留值之比
R值越大，表明相邻两组分分离越好 Rs<1，两峰部分重叠 Rs=1，两峰刚好分离(分离程度可达98%) Rs>1.5，两峰完全分离(分离程度可达99.7%)
r2,1 1 k ' n 分离度基本方程式： R ' 4 r2,1 k 1
' k 1 2 2 2 n 16 R ( )（ ） ' r2,1 1 k
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3、色谱图及常用术语
（1）色谱图：试样各组分经色谱分离后，从柱后流出进入检测
器，检测器将各组分浓度（或质量）的变化转换为电信号（电压或 电流），再由记录仪记录下来，所得的电信号强度随时间变化的曲 线，即为流出曲线，也称为色谱图，曲线上突起部分就是色谱峰。
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（a）柱内组分扩散 （b）相应的响应信号
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Cū-传质阻力项
物质迁移过程中存在的阻力
C Cm C s
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仪器分析 Cm：流动相传质阻力项系数，即为待测试样组分从流动相移动到固定相 表面的进行分配时所受到的阻力 2
, tR (2) , VR (2) , VR (1)
2,1
t
, R (1)

一般选择tR2’大于tR1’，所以值大于1， 越大，分离效果越好。
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色谱图 信息


色谱峰的个数——判断组分的个数 色谱峰的保留值——定性分析 色谱峰的面积或峰高——定量分析 相对保留值——固定相与流动相的选择是否合适 保留值、区域宽度——评价色谱柱分离效能的好坏
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理论优点：解释了流出曲线的形状，提出了计算和评价柱 效能高低的因素（n ） 如果若tR一定，那么n越大，H越小，则色谱峰越窄，柱 效能越高。

理论缺点： （1）色谱过纵向扩散等不能忽略， （2）塔板理论只能定性地给出板高的概念，不能解释板 高受哪些因素影响，无法提出降低塔板高度的方法 （3）不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同的 理论塔板数 （4）分配系数与浓度无关只能在有限的浓度范围内成立
分配系数
C s （组分在固定相中的浓度） K C m （组分在流动相中的浓度） ns k nm
'
（组分在固定相中物质的量） （组分在流动相中物质的量）
分配比
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nS cSVS VS k K nm cmVm Vm
'
分配系数影响因素：组分、流动相和固定相的热力学性质； 温度和压力等因素。
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（2）常用术语
①基线：柱中只有流动相流过时，检测器的响应信号记录值， 稳定的直线应是一条水平直线。 ②峰高h：色谱峰顶点与基线的垂直距离 峰宽：峰底宽Y 半峰宽：1/2h处的峰宽，Y1/2 标准偏差：0.607h处的峰宽为2 峰面积：
Y1 2 2.354
Y 4
A 1.065hY1 2 (对称峰）
2k Cs ' 2 3(1 k ) Ds
影响因素：容量因子k’ ，固定液液膜厚度df ， 组分在固定相中的扩散系数 Ds 结论：降低液膜厚度 浙江万里学院生物与环境学院

'
d2 f
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范氏方程
B H A Cu u 2 2 '2 ' 2 Dg d d 0.01k 2k p f 2 d p [ ] ' 2 ' 2 (1 k ) Dg 3(1 k ) Ds u
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A-涡流扩散项
由于流动相流经填充物的不规则空隙时，其流动方向改变，形成 紊乱的类似“涡流”的流动而引起
A 2d p
涡流扩散过程示意图 影响因素： ：填充不规则因子； dp：填充物平均直径 结论 dp越小（采用小颗粒填充物），越小（颗粒均匀），A就越小，空心 毛细管柱A＝0

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1982, less than 30 minutes separation for 18 of amino acids
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2、色谱法分类
（1）按流动相和固定相所处状态分


气相色谱（GC） 气液色谱（固定相为固定液，即固定相是附着在惰性载体上 的一薄层有机化合物液体） 气固色谱（固定相是固体吸附剂） 液相色谱（LC） 液液色谱 液固色谱


n 5.54(
n与半峰宽及峰底宽的关系
tR 2 t ) 16( R )2 Y1 2 Y
' ' t t n大于50，可得到峰形基本对称的曲线 n有效 5.54( R )2 16( R )2 Y1 2 Y 只要被分离组分K有差异，只要n足够大， L 经过反复多次的分配后均可进行分离 H有效 n有效
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（3）分配平衡
样品组分在固定相 与流动相之间进行 多次分配使其得到 分离。
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色谱分离原理及分离参数
样品在固定相与流动相之间进行分配，很快达到平衡，即分配平 衡。当流动相流过时，样品将在流动相和新的固定相中又达到分配平 衡，同时原来仍在固定相中的样品与新的流动相之间也会形成新的分 配平衡，随着流动相的不断流过，它们携带发生分配平衡后仍存在于 流动相中的样品沿着柱子向前流动，从而达到不同组分分离的目的。
（2）按固定相的固定方式分

柱色谱（固定相装于柱内的色谱法） 纸色谱（固定相是滤纸上的水分，呈平板状 ） 薄层色谱（固定相是吸附剂粉末制成的薄层，呈平板状）
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（3）按分离原理分

吸附色谱（利用组分在固定相上的吸附能力强弱不同 而得以分离的方法） 分配色谱（利用组分在（固定相）中溶解度不同而达 到分离的方法称为分配色谱法） 离子交换色谱（利用组分在离子交换剂（固定相）上 的亲和力大小不同而达到分离的方法） 排阻色谱（利用大小不同的分子在多孔固定相中的选 择渗透而达到分离的方法，又称凝胶色谱法）
分配比影响因素：组分、流动相和固定相的热力学性质； 温度和压力等因素；流动相及固定相的体积。
t R t0 t k t0 t0
' ' R
VR V0 V k V0 V0
' ' R
（组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此分 配比又称分配容量或容量因子）
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仪器分析
一、色谱分析法及其基本概念
1、色谱法的发展
1906年，俄植物学家M.Tswett分离植物色素
植物叶的色素组成
叶绿素a（蓝绿色）
叶绿素b（黄绿色）
胡萝卜素（橙色） 叶黄素（黄色）
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Developing of Chromatographic Technique