大豆抗病基因克隆的研究进展

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农林 论 坛 Ｉ Ｉｌ
大豆抗病基 因克 隆 的研 究进展
任 有科 ’ 张代 军
（． １ 黑龙江北大荒集５３ ２黑龙江省农垦总局红兴隆农业科研所 ， ５ １２ 、 黑龙江 友谊 １５ １ ） ５８ １
摘 要： 抗病基 因是在植物抗病反应过程中起抵抗病 菌侵染及扩展的有关基 因， 其是 Ｆ ｒ ｌ 经典遗传学基因对基 因（ ｎ—ｏ— ｃｅ ｏ ｇ ｅ ｆ ｇⅡ） ｅ ｒ 假说 中与病 原茵无毒基因相对应的一类基 因。 它存在于植物特定品种 中， 在植物生长周期或其 中某 阶段进行组成型表达。 随着生物技 术发展 已成功克隆许多
大 豆抗 病基 因 ， 抗 病基 因 工程 出现 了质 的飞 跃 。 使 关 键 词 ： 豆 ； 病 基 因 ； 隆 大 抗 克
Ｋ 和 ＮＲ 均呈诱导表达 。 Ｒ１ １ 在科 丰 １ 号中仅有 结构域是 高度同源于哺乳动物和果蝇 的信号传 Ｋ１ Ｒ ；在 南 农 １３ — １８ ２中 ， Ｒ１ Ｒ１的 比例 随 着 导 的受体 ，可能与激活防卫基因的转录因子有 Ｋ ／ Ｎ Ｓ ＭＶ接种的时间而变化 ， 最终 Ｋ Ｒ１占优势 。此 关。与烟草的 Ｎ基 因、 亚麻的 Ｌ ６基因及拟南芥 结果 预示着 Ｋ Ｉ可能是一个新 的抗花 叶病毒 的 Ｒ Ｐ 等基因类 似 。Ｒ 基 因 Ｎ端有 １２ Ｒ Ｐ５ Ｓ１ ４ 个 基因 ， 它的表达受 Ｓ Ｖ的诱导。 Ｍ 氨基酸序列为 ＴＲ结构 ，可能在抗病反应 中起 Ｉ 得转座子突变体 。大豆是古 四倍体 ，基因组复 利用所获得的大豆抗病基因同源片段为混 着类 似的作用 。Ｎ Ｄ结构域具有激 酶活性 ， Ｂ 此 杂 ，因此大豆抗病基 示着它们在发挥正常功能时有可能需要 慢。 Ｒ基因保守 区有助于对抗病基因克隆， 即利 Ｋ ３和 Ｋ ４ Ｒ Ｒ ，通过 Ｒ Ｃ Ａ Ｅ方法获得 了全 长 ， 其 结 合 Ａ Ｐ或 Ｇ Ｐ可 以激活 其它 的功能 蛋白。 Ｔ Ｔ Ｒ ６ ２ ｐ 有一个 完整的编码框 ， Ｌ Ｒ结构 被认 为在蛋 白质 的相互作用 中起 重 Ｒ 用 Ｒ基因同源序列 法来克 隆抗病 基因 ， 依此方 中 Ｋ ３长度为 ３７ ｂ ， 法在 大豆中获得 了大量 的抗病基 因的 同源片 编码 １２ １４个氨基酸 的蛋 白。ＫＲ ３与烟草抗花 要作用 ， 它不仅参与抗病反应的识别 ， 还与识别 段。 叶病毒 Ｎ基 因具有较高 的同源性 （ 似度为 以后的抗病信号的传导有关 。 相 胞质 ｕｔ Ｒ的保守 Ｙ 等 （９ ６ 根据烟 草 Ｎ基因和拟南芥 ２ ． 。 ｕ １９ ） ８１ 具有 ＴＲ和 Ｎ Ｓ等抗病 基因具有 的保 序 列 模 式 为 ”，ｉ ｘ￣ Ｃ ｒ ．Ｓ １ 因 的 ％） Ｉ Ｂ １ｘ １ ． ａ ． ｘ ｘ ＂ Ｒ 基 ，。 Ｌ ＲＳ Ｐ ２基 因的 Ｎ Ｓ区同源序列 设计简 并引物 ， 守结构域 。Ｋ Ｂ Ｒ３的表达受水杨 酸诱 导 ， 因此可 Ｌ Ｒ区含有此保守序列 ， Ｒ 可能位 于胞质。 从大豆中扩增并克隆出 ｌ 类含 Ｎ Ｓ序列 的片 能是 大豆 中具有 功能的类似 Ｎ基 因的一类 抗 １ Ｂ 丁海等 （０ ３ ２０ ）根据已知抗病基因的 Ｎ Ｓ Ｂ 段。同年 Ｋ ｎｚ 等根据 烟草 Ｎ基 因、拟南芥 病基因。 Ｒ ａａ ｎ ｉ Ｋ ４全序列为 ３ １ｂ ， ８ ８ ｐ 编码 １ １ 个氨 保 守序列 区设计 ４对简并 引物和 ｌ 特异引 ２１ 对 ＲＳ Ｐ ２基 因和亚麻 基 因的 Ｎ Ｓ区 同源序列 基 酸 ，在 Ｇ ｎ ａｋ 中 的 注 册 号 为 Ａ ５ ２ ８ 。 物， Ｂ ｅＢｎ Ｆ ０ ０ ０ 以大豆农家种兴县灰布支黑豆为材料 ， 应用 设计简并引物 ，从大豆 中扩增并克隆出 ９类大 Ｋ ４在结 构上与水稻 抗 白叶枯病基 因 Ｘ ｌ Ｒ ａ 有 Ｐ Ｒ方法 获得 了 ｎ 条 来 自基 因 组 Ｄ Ａ的 Ｃ Ｎ 豆抗病基因类似序列 。 定位分析表明 ， 同源 １．％的相似性 ， 这些 ６０ 具有 Ｎ Ｓ Ｌ Ｒ等抗病基 因的 Ｒ Ａ序列 和 ２ Ｂ 、Ｒ Ｇ 条来 自ｅ Ｎ Ｄ Ａ的 Ｒ Ａ序列 。 Ｇ 序列 片段成簇分布 ， 提供抗病基因的潜在位点 ， 有些 结构特征。Ｓｕ ｅ 结果证明 Ｋ ４ ｏｔ ｒ ｈｎ Ｒ 在抗病材料 长度在 ５ ０ ６ ３ ｐ ０ － ３ ｂ 之间 ， 中 ８ 其 条来 自 基因组 还与已知抗病基因连锁 。尽管这种方法对于鉴 科丰 １ 号和南农 ｌ３— 中具有多态性 ， ８２ １ 连锁分 Ｄ Ａ和 ２ Ｎ 条来 自ｃ Ｎ Ｄ Ａ的 Ｒ Ａ序列 已在 Ｇ Ｇ 锄一 定潜在的基因位点是非常有效的 ， 但对于其功 析将 Ｋ ４定位在 Ｅ连锁群 Ｒ 。ＫＲ ４的表达受水 Ｂｎ 登录。 ａｋ 这些序列都不同程度的含有 Ｎ Ｓ Ｂ 保 能的鉴定则是非常困难的。因为抗病基因家族 杨 酸的诱导 ， 大豆花叶病毒株 系 ｓ ａ和 Ｎ ３的接 守 区的 Ｐ 一环 （ Ｖ Ｋ Ｔ）ｋｎｓ－ Ｖ ＤＤ） ＧＧ ｅ Ｔ 。ｉａｅ２（ 【 ． 的研究表明其中有些成员是无功能的。 因而 ， 从 种都 能够诱导 Ｋ ４的表达 ，因此 Ｋ ４可能参 ｋ ａ － （ Ｓ Ｉ） Ｒ Ｒ ｉ ｓ ３Ｇ ＲＩ及跨膜区 Ｇ Ｐ ｎｅ Ｌ Ｌ等特征结构 的 中分离抗病基因同源序列则可 以获得由功 能的 与 大 豆抗 ｓ 的过程 。 Ｍｖ 序列 ，由此推导 出的氨基酸序列同已知抗病基 潜在抗病基因成员Ｂ Ｉ 。 杨秀红 （０ ５ 根据 拟南芥 Ｒ Ｓ ２０ ） Ｐ ２基 因 、 烟 因 Ｌ ， Ｐ ， ． ， ６ Ｒ ＭＩ Ｓ Ｎ编码 的氨基酸序 列表现 ２ 贺超英 等（０ １根据 烟草抗花 叶病 毒 Ｎ 草 Ｎ基因和亚麻 基 因的保 守结 构域设 计简 出从 ２ ％一 ２ ２０ ） ５ ４％的同源性目 。 基因和拟南芥抗 丁香假单胞杆菌 Ｒ Ｓ 基 因设 并引物， Ｐ２ 从大豆抗疫霉根腐病 品种绥农 １ Ｏ号的 Ｂ ａ （０ ５ Ｒ ｓｋ ｈｔ ２ ０ ） ｐ ｌ 位点 ， ｍ 克隆得到高同源 计兼并引物 ，从大豆抗花叶病毒 品种科丰 １ 号 Ｒ Ａ中扩增获得 了 １０个克隆 ， 中鉴定 了两 性 的 四个 基 因 Ｒ ｓｋ ｌＲ ｓｋ ２ Ｒ ｓｋ ３和 Ｎ ０ 从 ｐ ｌ— 、 ｐ ｌ－ 、 ｐ ｌ－ 的基因组 中扩增获 得 ３ ８ ５ 个克隆 ，鉴定出 ４ 个 个通 读的且 与抗病基 因 Ｎ Ｓ Ｂ 结构域 同源的序 Ｒ ｓｋ ４ 编 码 蛋 白 的 保 守 结 构 域 为 ｐ ｌ一 ， 通读的且与抗病基因 Ｎ Ｓ 构域同源的片段 ： 列 Ｒ Ｅ 一 Ｂ结 Ｎ Ａ １和 Ｒ Ｅ 一 ，这两个序列 长度均为 Ｃ — Ｂ — Ｒ ￣卷 曲结构 （ ｏ ｅ ｏ ）和核 Ｎ Ａ２ Ｃ Ｎ Ｓ Ｌ Ｒ［ Ｃｉ ｄ Ｃ ｉ 、 ｌ ｌ Ｋ Ｂ ＩＫ Ｂ ２ Ｋ Ｓ Ｎ Ｓ 、 Ｎ Ｓ 、 ＮＢ ３和 Ｋ Ｂ ４ Ｎ Ｓ 。构 建 了一个 ５ ３ ｐ 编码 １ １ 氨基酸 ， １ｂ ， ７个 编码产物 在结构上 苷酸结合位点 （ ｕｌ ｆ ｅ Ｂｎｉ ｉ ）结构 Ｎ ｅｏｄ ｉ ｎ Ｓｅ ｅｉ ｄ 构域的 环 ， ｉａｅ ２ 其 ． ２ Ｂ Ｋ ｎｓ－ ａ和 Ｋ— 域、 ｉ 亮氨酸重复序列（ｅｅ ｅＲｃ ｅｅｔ ， Ｌｕｉ —ｉ Ｒ ｐａ ］ ｎ ｈ ） 按 １＇ｕｍｌ 利用所获得的大豆抗病基 因同源 ｎ ． ａ区及保守的疏水结构域 ＨＤ 。序 列与 照序列特征分 类可分为 两类 ：其 中 Ｒ ｓｋ １ ０ ｆ／ ；并 ｐ ｅ ３ － 源性 表 明 Ｒ Ｅ — Ｎ Ａ ｌ和 Ｒ Ｅ 一 Ｎ Ａ ２为 Ｒ ｓｋ ３ Ｒ ｓｋ ４ 一类。Ｒ ｓｋ ２为第 二 ｐｌ一 和 ｐｌ － 为 ｐ ｌ－ 性 克隆 Ｋ 和 Ｋ ２ 。Ｋ ＲＩ ． ｔ Ｂ１长度为 ３ ７ ｂ ， Ｒ￣ ６ ２ ｐ 有 大 豆抗 病 基 因 同 源 片段 。ＲＮ Ａ— 与 从 携带 有 类 。经转基因验证 Ｒ ｓｋ ｌ Ｅ ｌ ｐｌ— 具有抗大豆疫霉根 个完整 的编码框 ，编码 １２ 个 氧基酸的蛋 抗疫霉根腐病基 因（ ｐ２ 的大豆近等基因系中 腐 病 功 能 ４ １ Ｒ ｓ） 。 白； Ｒ Ｋ ２长度为 １ ６ｂ ， ５０ ｐ 为不完整编码框 。Ｋ １ 获得 的 ＣａｓＤ类大豆 同源序列在分类上 比较 Ｒ ｌ ｓ Ｌｇｔｏ 实 验 室 从 Ｆ ｒ ｓ ｊｈｆ ｔ ｏ ｏｒ ｔ的 Ｂ Ｃ克 隆 ｅ Ａ 在 结构上与烟草抗花 叶病毒 Ｎ基 因具有较 高 近源 ， Ｎ Ａ ｌ与 Ｃａｓ Ｄ同 源性 高达 ９ ％。 ７ １ ＲＥ～ ｌ ｓ １ ３％和 ＩＯ Ｉ Ｏ ＢＯ中获得 了 Ｒ ｇ ｈ ｌ和 Ｒ ｇ ｈ ４的全长 的 同源性。它具有 ＴＲ、 Ｂ Ｉ Ｎ Ｓ和 Ｌ Ｒ一 系列 抗 Ｃａｓ Ｄ被定 位 在大 豆 Ｊ连 锁 群 上 ，与大 豆 ｅ Ｎ Ｒ ｌ ｓ Ｄ Ａ序列 ， 随着这两个基 因的克隆成功 ， 以及 病基因的分子特征 ，因而它可能是大豆中具有 Ｒ ｓ ｒ ｐ２、 ｍｄ基 因有 关 （ ｕ １９ ） Ｙ ，９６ 。 根据基 因序列相应设计引物的合成 ，相信会使 功能 的类似 于