荧光光谱基础知识

荧 光 光 谱(Fluorescence Spectroscopy )
韩荣成(10303023)
北京大学,03级生物医学工程
一、背景知识：
1.荧光，是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。

除了紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X 射线荧光等。

在很多情况下，分子从激发态回到基态过程中，能量通过热量等形式散失到周围。

但 是在某些情况下，能量能以光子发射的形式释放出来。

分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能量有：E 0=Ee+Ev+Er ，其中Ee:价电子运动能（electron ）； Ev ：原子在平衡位置的振动能（vibration ）；Er ：分子绕其重心的转动能（rotation ）。

Ee 大
约为1eV 数量级；Ev 大约为10－1～10－2 eV ；Er 大约为10－4～10－5eV 数量级，
可见⊿Ee>⊿Ev>⊿
Er
分子吸收能量后，处于激发态的分子通过非辐射过程丢失能量，首先到达S1的最低振动能
级，这一过程称为内转换（internal conversion）,发生在10－11s内。

从S1的最低振动能级以光子形式放出能量而回到基态的不同振动能级，这一过程称为荧光
（fluorescence）,发生在10－9s内；如果以非辐射的形式丢失能量则称为淬灭
（quenching）。

如果某种物质在被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发出比
荧光波长更长的波长的光，则称这种光为磷光。

磷光产生的机制与荧光是不同的，虽然它们都属于发射光谱，但磷光不是处于第一电子激发态的最低振动能级的分子直接释放出光子回到基态的结果，而是从某种能量低于第一电子激发态的最低振动能级的另一种亚稳能级⎯三重态向基态的各振动能级以辐射方式产生跃迁时发出的光。

所谓三重态或三线态，是指分子中电子自旋量子数S=1，即原来两个配对的自旋
方向相反的电子之一自旋方向改变，以至电子自旋之和不为0的情况。

处于第一电子激发态最低振动能级的分子，有可能通过无辐射跃迁(系间交连，intersystem crossing)消耗部分能量，其中一个电子的自旋方向倒转，从而处于三线态。

从三线态的最低振动能级向基态的各振动能级跃迁并释放出光子，则其发光为磷光。

由于三线态的电子自旋和不为零，这种跃迁是一种被禁跃迁，即跃迁几率很小。

这样，
在三线态停留的时间即寿命就比较长(从10-3秒到数秒)，强度很弱。

由于三线态能
量低于第一电子激发态最低振动能级，因此磷光的波长比荧光长。

二、荧光光谱：
荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。

激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作
用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，
也就是荧光中不同波长的光
成分的相对强度。

激发谱既然是表示某种荧光
物质在不同波长的激发光作
用下所测得的同一波长下荧
光强度的变化，而荧光的产生
又与吸收有关，因此激发谱和
吸收谱极为相似，呈正相关。

由于激发态和基态有相似的
振动能级分布，而且从基态的
振动能级跃迁到基态各振动能级的几率也相近，因此吸收谱与发射谱呈镜象对称关系.λex:maximum excitation wavelength; λem(λax): maximum emissio
wavelength
最低振动能级跃迁到第一电子激发态各振动能级的几率与由第一电子激发态的最低n
2.荧光光谱仪和主要谱参数
2．1荧光光谱仪
荧光谱仪结构上的最主要特点是入射的激发光与荧光探测方向垂直。

1. 光源：现在多用氙灯，氙灯在200-800nm范围内具较好的发射谱。

2. 入射光单色器：入射光单色器是用来选择特定波长的单色光，入射到样品上。

荧光分光度计中采用光栅作为单色器。

激发波长择描就是靠它来改变波长。

3. 监视探测器：这个探测器用来监测光源的恒定性。

4. 光闸：光闸关闭时，入射光被挡住，不能照到样品上，这样可以防止样品长期受到照射而产生化分解。

另外，在打开样品室的盖时，关上光闸，可以防止读数过大，给图笔撞击端部。

5. 样品杯：样品杯是10mm×10mm的石英杯，四面透明，且用去荧光石英材料制成。

注意荧光样品杯不能用紫外谱仪中的样品杯代替。

6. 发射光单色器：用来选择一定波长的光进入探测器测量。

发射光择描就是用它来实现的。

7. 计算机辅助记录系统：用以完成绘图及荧光强度的测量。

2.2主要的谱参数
2．2．1荧光寿命(fluorescence lifetime)
去掉激发光后，分子的荧光强度降到激发时最大荧光强度的1/e所需要的时间，称为荧光寿命，常用τ表示:
τ=1/k――――――（1）
证明：I t=I 0e-kt
其中I 0是激发时最大荧光强度，I t是时间t时的荧光强度，k是衰减常数。

假定在时τ时测得的I t为I 0的1/e，则τ是我们定义的荧光寿命。

01I e
I t = 则有：τ=1/k
如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量，则荧光寿命与荧光发射的速率常数成反比，速 率常数即为单位时间中发射的光子数，因此有τF =1/K F 。

K F 是速率常 数。

τF 表示荧光分子的 固有荧光寿命，k F 表示荧光发射过程的衰减常数。

如果除荧光发射外还有其它释放能量的过程 (如淬灭和能量转移)，则寿命τ还和这些过程的速率常数有关，结果是荧光寿命降低。

由于吸收
几率与发射几率有关， τF 与摩尔消光系数εmax (单位为cm 2mol -1或(mol dm --3) -1cm -1)也就密切相关，
从下式可以得到τF 的粗略估计值(单位为秒)。

1/τF ≈104εmax
在讨论寿命时，必须注意不要把寿命与跃迁时间混淆起来。

跃迁时间是跃迁频率的倒数，
而寿命是指分子在某种特定状态下存在的时间。

通过量测寿命，可以得到有关分子结构和动力学 方面的信息。

2．2．2荧光量子产率(quantum yield)：
荧光量子产率是物质荧光特性中最基本的参数之一，它表示物质发射荧光的本领。

荧光量
子产率通常用φ来表示，定义为发射量子数和吸收量子数之比，即由荧光发射造成的退激分子在全部退激分子中所占的比例，又称为荧光效率。

φ＝ 发出量子数/吸收量子数。

处于激发态的分子，除了通过发射荧光回到基态以外，还会通过一些其它过程回到基态。

其结果是加快了激发态分子回到基态的过程(或称退激过程)。

φ =τ/τF
证明：总的退激过程的速率常数k 可以用各种退激过程的速率常数之和来表示:
k =k F +∑k i
k i 表示各种非辐射过程的衰减速率常数。

则总的寿命τ为:
τ=1/k =1/(k F + ∑k i )
因此，量子产率又可以表示为
∑+=i
i F F F k K K φ
因为 1/k F =τF ， τ=1/(k F +∑k i )
所以 φ =τ/τF
φ的绝对值是较难用实验的方法测量的，因为必须事先知道仪器的修正因子。

实际测量中大 多采用相对法，即用已知量子产率的标准样品与待测样品进行比较。

证明：对稀溶液来说，荧光强度F 与吸收度A 成正比:
F =kI 0A ϕ
这里k 是比例常数，I 0是吸收前的光强度， φ 是荧光量子产率。

若两种溶液测量条件完全相同，则:
F 1/F 2=A 1φ 1/(A 2φ 2)
φ 1/φ 2=F 1A 2/(F 2A 1)
已知φ 2就可求出φ 1。

由于各种竞争性过程而使荧光量子产率减小的现象称为淬灭(quenching)，如温度淬灭，杂质
淬灭等。

量子产率对于生色团周围的环境以及各种淬灭过程很敏感。

量子产率的改变必然会
引起荧光强度的改变。

因此，如果只要研究量子产率的相对值，只要量测荧光强度也就足够了。

2．2．3荧光强度：
荧光强度F 取决于激发态的初始分布I A 与量子产率φ的乘积。

Ｆ=I A φ这里的F 指的是向各个方 向上发射的荧光强度的总和，实际上，谱仪收集的只是其中的一小部分。

因此仪器测到的荧光强 度Ｆ=I A φ Z ，这里Z 是仪器因子。

椐据Beer-Lambert 定律（A = KCL ，朗伯-比耳定律同时反映了溶液厚度L 和浓度C 对光吸收A 的关系,其数值随光的波长、溶液浓度和溶液的性质而定）
I A =I 0-I t =I 0{1-exp[-2.3ε (λA )·C ·l]}
式中ε (λA )为激发波长处的消光系数，Ｃ为样品分子的浓度，I 0为入射光强度，I 0为透过样品后的 光强度，l 为光程（样品池光径）。

对于稀溶液，吸收很稀，ε (λA )很小−<<2.3ε (λA )C ·l ＜＜1， 因此，1-2.3ε (λA )C ·l ≈exp(-2.3ε (λA )C ·l)
I A =I 0(1-(1-2.3ε (λA )C ·l)) =2.3I 0ε (λA )C ·l
F λ=I A φZ =2.3I 0ε (λA )C ·l ·ϕ·Z
如果激发光强保持不变，且ϕ和Z 与激发波长无关，则F ∝ε (λA )很显然，荧光强度与样品在波度λA 处的消光系数有关，而消光系数与激发波长是密切相关的，消光系数随波长的变化即吸收谱， 因此荧光强度也随激发波长的变化而变化。

激发谱与吸收谱的正相关关系在此一目了然。

当然，实际上仪器因子Z 与波长是有关的，这就使得激发谱与吸收谱并不完全相似。

2.2.4荧光偏振（fluorescence polarization ）
偏振片：吸收某方向光振动，而与其垂直方向的光振动能通过的装置
偏振化方向：能通过光振动的方向
自然光通过偏
振片后变为线偏振光，称为起偏; 线偏振光:光矢量只沿一个固定方
向振动的光(又称平面偏振光)
利用偏振片检
验光线的偏振化
程度，称为检偏
荧光偏振度P＝（I //- I ⊥）/ (I //+ I ⊥)
荧光各向异性A= (I //- I ⊥)/(I//+2I ⊥)
可以证明I //+2 I ⊥为荧光总强度，
（1/P-1/3）-1=(2/3)A
Perrin公式：1/P±1/3=(1/P 0±1/3)(1+3τ/ρ)
=(1/P 0±1/3)(1+RTτ/ηV 0) 其中，P 0为极限偏振度，τ为荧光寿命，R气体常数，T绝对温度，η为粘滞系数
V 0为分子体积（按球形计算），ρ旋转迟豫时间。

研究大分子性质以及与小分子的相互作用。

不同生理条件下生物大分子的P 不同，可以借此诊断疾病。

3 讨论：
（1）环境因素对λmax 的影响：
a.环境(如溶剂)的极性对λmax 的影响---同一种荧光物质在不同极性的环境中，其λmax 可能会有所差别。

一般来说，激发态的极性比基态要强，因此被激发的荧光分子将趋向于与极性溶剂（或极性环境）相互作用，使溶剂分子的电子分布会发生变化，偶极子重新取向，而这又会反过来影响荧光分子的基态和激发态能级，减少激发态的能量，引起发射谱的红移这种影响的结果可
以用Lippert 方程来解释：32
*22)(1211212a n n hc f a µµεεσσ−⎟⎟⎠⎞⎜⎜⎝⎛−−−−−≅−＋常数
其中，σa 与σf 分别为荧光分子的吸收波数与发射波数，σa −σf 反映了吸收光与发射光
能量的差别；ε为溶剂的介电常数；h为普朗克常数；c为光速，a为荧光分子在溶剂
中所占空穴的半径，
µ∗与µ分别为荧光分子处于基态和激发态时的偶极矩。

由上式可见，折射率增加使能量差减少，而介电常数增加会使能量差增大。

由于荧光分子激发态的偶极矩µ∗一般要大于基态偶极矩µ，荧光分子偶极矩的增大与溶剂分子相互作用，使溶剂分子的电子分布和偶极子取向发生变化。

溶剂偶极子的重新取向需要比电子重新分布长得多的时间。

介电常数ε不仅与偶极子取向有关，也与电子取向有关，
上式中第一项(ε−1)/(2ε−1)是电子和偶极子重新取向的结果；
折射率n与电子重新分布有关，因此上式中第二项是电子重新分布的结果。

由于非极性溶剂分子没有偶极矩，因此没有在激发态荧光分子的作用下偶极子重新取向的问题，ε≈n 2， σa −σf 很小。

而在极性溶剂中σa −σf 较大，产生红移.值得
提出的是“环境极性加强，λmax 红移”的规律，并不是绝对的。

例如，如果在激发态
的寿命之内，分子没有足够的时间来重新排列并降低激发态的能量，则可能发生λmax 兰移的情况。

这种现象称为“orientation constraint”。

这说明在利用λmax 作为环
境极性的探针时要十分谨慎。

b.pH值对λmax 的影响：
如果荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对λmax 有影响。

这是因为弱酸
和弱碱分子和其离子在电子结构上有所不同，因而荧光λmax 也可能发生变化。

例如，
1-萘胺-5-磺酸在不同pH值时，会以两种不同离子的形式存在，这两种离子的荧光波长是不同的。

利用这种效应，可以将其荧光波长作为pH值的指示剂。

C. 溶液粘度对λmax 的影响
溶液粘度有时也会对λmax 有影响，例如TNS在蔗糖水溶液中的λmax 会随蔗糖浓度的
变化而变化。

当蔗糖浓度由10%增加到60%，粘度从1.3分泊增加到58分泊，λmax 以580nm兰移到555nm。

d.共振能量转移对λmax 的影响
如果两种生色团荧光频率接近，则当两种基团足够接近时，用一种生色团能吸
收的光激发使之处于激发态后，处于激发态的这种生色团可能将激发能转移到另一种生色团，使第二种生色团进入激发态，产生第二种生色团特有的荧光，这种现象称为共振能量转移。

显然，共振能量转移对λmax 可能造成影响。

(2) 环境对荧光量子产率φF 和荧光强度的影响
由于稀溶液中荧光强度F λ=KI 0A φ F ，（这里I 0是激发光强度，A是光密度或吸收
度，φ 0是荧光量子产率，K为常数）因此凡是会影响荧光量子产率φF 的环境因素也
必然会影响荧光强度。

a.溶剂（或环境）极性的影响
量子产率（荧光强度）会随着溶剂（或环境）极性的减小而增加。

这一点前面
已经提到过。

一种可能的机制是：在非极性的溶剂中系间交连（转移到另外的激发态）的速率会减少。

B.光化分解
荧光物质因吸收光能而造成某一键断裂的现象称为光化分解
（photodissociation），光化分解会造成荧光逐渐减弱。

尤其是对于稀溶液来说，光化分解就更为严重。

通常，为减少光化分解现象造成的影响，可采取以下措施：
I. 减少光照时间和强度II. 由于稀溶液更容易变质，而样品在浓溶液中要稳
定一些，因此储备液要配得浓一些，使用前再稀释。

III. 仪器本身的改进如提高检测器灵敏度，降低光源强度等，也有利于减少光化分解。

C. 温度对荧光强度的影响
一般来说，溶液的荧光强度随温度的降低而增强，温度的升向与荧光强度的减弱在一定范围内是线性关系。

温度每升高1°C，荧光减弱的百分数称为温度系数。

一般荧光物质的温度系数大约为1%，但有些荧光物质可大到5%。

温度升高，荧光强度减弱的原因主要是溶液的粘度减小，溶剂与溶质分子的动能增加，使得荧光分子的其它分子之间的碰撞几率增加，激发态荧光分子通过分子间碰撞或分子内能量的转移，将自己的能量转移出去。

以非荧光发射的形式回到基态，这就造成荧光淬灭，量子产率降低的情况。

如果溶液中有淬灭剂存在，则淬灭剂的作用也会随温度升高而增大。

为减少温度对荧光强度的影响，可采用恒温样品架维持样品温度的恒定。

d.样品浓度对荧光强度的影响：
在样品浓度较低时，荧光强度与荧光物质的浓度成正比。

但到了一定浓度以后，就不再存在这种正比关系。

这是因为：荧光强度F=KφεI
(1−e−εlc)，这里K是仪器常数，φ是量子产率，I0是激发光强度，ε是克分子消光系数，l是样品池光径，C是样品浓度。

浓度增加到一定程度后，接近0，浓度继续增加，荧光强度不再增加。

只有样
品浓度很稀时F=KI
0φ [1−(1−εlc)]=KI
φεlC。

荧光浓度过大时，常常发生淬灭现象。

这样就使荧光强度反而大大低于接近饱和时的荧光强度。

淬灭产生的原因至今仍众说纷纭，最简单的解释是：单线能级的激发分子在发出荧光之前就和未激发的荧光物质分子碰撞而自淬灭浓度过高，可能形成样品分的二聚体或多聚体。

因而降低荧光强度。

产生浓度淬灭的重要原因之一是荧光分子在样品池中分布均匀：当溶液较稀时，均匀分布在样品池中的荧光收强烈，越进入溶液，发荧光分子越少，因而大量的激发光在到达池内之前就被吸收了。

这样，从垂直于激发光方向的角度来接收荧光，检测到的荧光就很微弱了。

即使是在靠近入射光的面上，也只有靠近检测器的面上荧光容易被接收到。

离探测器较远的荧光分发出的荧光又会被瓣面的荧光分子吸收（如果物质本身的吸收光谱和发射光谱有重叠的话），即大部分荧光发射在离开吸收池前就又被吸收。

解决浓度淬灭的办法之一，是将样品尽量稀释到荧光强度与荧光染料宵度成范围线性关系的深浓度来测量。

浓度淬灭的现象有时也可以加以利用，例如在脂质体里包裹高浓度的荧光染料，由于浓度淬灭，包裹在脂质体内的荧光染料荧光强度很低。

一旦荧光染料从脂质体内泄漏出来，由于荧光染料浓度下降，进入线性区，因此荧光强度大大增加。

e.杂质对量子产率（荧光强度）的影响
f. pH值对量子产率和荧光强度的影响
如荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对荧光强度有较大影响。

利用这些物质对pH值的敏感性，可以将它们用作pH指示剂，或利用它们在不同pH值溶液中荧光强度的改变来判断酸碱滴定的络点（特别是在有色或混浊的溶液中）。

g.溶液粘度对荧光强度的影响
荧光强度一般随介质粘度的升高而增强。

因为介质粘度增加，减少了分子碰撞，
从而减少了能量损失。

例如荧光物质NTS在不同浓度的蔗糖水溶液中，荧光强度随
粘度增加而增加。

H.膜电位的影响
有些能和膜结合的荧光分子的荧光强度会随着膜电位的改变而改变，这种变化
有的是由于带电的荧光染料随膜电位变化而在膜内外重新分布。

有的是由于荧光分
子的荧光谱在电场下发生改变（电生色性， electro chronism）。

按照对膜电位变
化的反应速度，大小和光学信号改变的机制，这类电位敏感的荧光染料又可以分为
慢反应染料和快反应染料。

这种现象可以用来监测膜电位的变化。

i.其它各种干扰因素:
还有一些其它的干扰因素可能影响荧光强度，例如光散射就可能影响荧光强度。

区分散射光和荧光发射的依据，是散射光与激发光波长相同，离荧光峰较远。

荧光
污染也是影响荧光强度的一种因素
三．荧光分析在生物学中的应用
荧光分析应用的范围很广。

生物学和医学的各个学科，包括生理、生化、
生物物理、药理、免疫、细胞、遗传等，都可以使用这一技术。

从研究的材料来
看、氨基酸、蛋白质核酸、维生素酶、药物、毒物等都可以采用。

下面就内源荧
光和外源荧光在生物学、医学中应用的可能性，举一些例子。

3.1内源荧光的探测和应用
生物学中比较重要的天然荧光分子多属具有共轮双键的系统。

如芳香氨基酸、核黄 素、维生素A、卟啉、叶绿素、NADH和tRNA中的Y碱基（二氢尿嘧啶）等。

对于
含有这些天然荧光物质的样品，可以直接通达量测其荧光来确定其存在，分布及数量。

3.1.1蛋白质的内源荧光
蛋白质的荧光来自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。

它们的相对荧光强度为
100:9:0.5。

检测蛋白质的天然荧光，可采用280nm的激发波长，发射波长范围
在340-350（蛋白溶液为中性时）。

如果蛋白中不含色氨酸，只含苯丙氨酸和酪
氨酸，则荧光光谱主要表现酪氨酸的特征，最大发射波长约为304nm。

对于含有
色氨酸的蛋白，荧光光谱则主要表现色氨酸的特征，最大荧光发射在320-350nm
之间。

3.1.2维生素的内源荧光分析
3.2 外源荧光的应用：
荧光探针，即外源荧光技术。

目前，荧光探针的种类已经有上千种，人们可以根据所 研究问题的不同，选择不同的荧光探针。

3.2.1蛋白质的荧光标记：
3.2.2核酸的荧光标记：
3.2.3 生物膜的荧光标记
3.2.4金属代谢的荧光监测
3.2.5 荧光探剂作为pH指示剂
参考文献：
1.赵南明，周海梦，生物物理学，北京：高等教育出版社，海德堡：施普林格出版社，2000
2.林克椿，生物物理技术　波谱技术及其在生物学中的应用，北京：高等教育出版社，1989
3.林克椿，吴本玠，医学生物物理学，北京医科大学。

中国协和医科大学联合出版社，1996
4．SNL讲义
生物物理技术综述 11。