05 实验五 产酶菌株生长曲线的测定
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从分子水平上，对生物个体的DNA、RNA和蛋白质进 行研究，并根据获得的基因型信息对生物个体进行分 类的方法。
DNA G+Ｃmol% DNA 分子指纹分析 DNA-DNA杂交 核酸序列分析（16srDNA、ITS等）
（二）微生物的生理生化反应
1、淀粉水解实验 2、糖发酵试验 3、MR（甲基红） 4、V-P（伏-普）
一、目的意义
1、了解常见微生物生长曲线的测定方法 的原理特点及其适用范围
比浊法、干重法……
2、掌握比浊法测定细菌生长曲线的方法
二、材料方法
关键技术:
分类鉴定手册的使用 分类鉴定的标准流程 标准菌株参比
二、材料方法-基本原理
（一）微生物生长曲线的测定方法
多相分类法：Colwell1970年提出，指利用微生物
等分别划线接种，并在平板背面标注菌种名称。 37 ℃倒置培养24-48小时 观察各种细菌的生长情况。将平板打开盖子，滴入少量Lugol’s碘
液，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板 观察菌落周围有没有透明圈出现。透明圈和菌落的直径大小可以
初步判断菌体解淀粉的活性。
2、糖发酵试验
用记号笔在装有糖发酵培养基的试管壁上分别表明培养基名称和 所接种的细菌菌名。
传统分类是认识微生物实际重要性和研究 生物进化的基础。
2、数值分类
是随着信息数字化时代的发展，根据微生 物分类学信息，应用计算数学原理和技术辅助 定义微生物分类单元的一种方法。
主要是向分类学家提供准确的、可重复的 、大信息量的处理手段。
3、化学分类
是研究微生物细胞不同化学特性，并利用 这些特性对生物个体进行分类和鉴定。
由于细胞化学成分及分子结构的稳定性好 ，因此化学分类是原核微生物系统分类学的主 要方法之一。
3、化学分类的常用方法
细胞（壁）化学组分分ຫໍສະໝຸດ Baidu 枝菌酸分析（诺卡氏菌） 磷酸类脂分析 脂肪酸组分分析 醌组分分析 全细胞蛋白SDS-PAGE分析 核糖体蛋白双向凝胶电泳（2D-PAGE）
4、分子分类
非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。
此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧 化成二乙酰。二乙酰与蛋白质中的精氨酸的胍 基作用，生成红色化合物，即为VP试验阳性。
实验材料
1. 菌种 待鉴定菌株：分离物； 参比菌株：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等 2、培养基 3、仪器或其他用具
1. 淀粉水解试验
将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃，无菌操作制成平板。 用记号笔在平板底步划成三部分，将枯草、大肠杆菌、变形杆菌
第二次实验：
（一）接种： 将活化好的菌种接种到鉴定培养基中 按照要求进行培养。 观察记录其菌落形态、菌体形态 革兰氏染色
第三次实验：
（一）完成菌种鉴定实验
理化指标（糖发酵、明胶液化、MR、VP）
（二）菌种生长曲线试验准备
三、数据结果
四、讨论分析
分类鉴定的程序 分类鉴定指标的确定 ……
微生物学实验技术
一株产中性蛋白酶芽孢细菌的选育
实验内容
一、产中性蛋白酶芽孢细菌的初步筛选 二、产中性蛋白酶芽孢细菌的诱变育种 三、产中性蛋白酶芽孢细菌的发酵复筛 四、产中性蛋白酶芽孢细菌的分类鉴定
五、产酶菌株生长曲线的测定
六、产酶菌株的菌种保藏
实验五 产酶菌株生长曲线的测定
一、目的意义 二、材料方法 三、数据结果 四、讨论分析 五、参考文献
取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接入大肠杆菌、枯草杆菌、 普通变形杆菌，对照不接种。另取乳糖发酵培养基试管3支，操 作同上。
接种后，轻轻摇动试管使其混合均匀，防止倒置的小管进入气泡 将接过种的和作为对照的6支管均置于37℃培养24~48小时。 观察各试管颜色变化以及杜氏小管有无气泡。
4、MR、VP试验
多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育 的信息，综合研究微生物分类和系统进化的过程。多 相分类法几乎包括了现代分类中所有的方面，如传统 分类、化学分类、分子分类、数值分类等，被认为是 目前研究各级分类单元最有效的手段，可用于所有水 平上的分类单元的描述和定义。
1、传统分类法
也称描述分类，主要指以形态特征、培养 特征以及生理生化特征等表观分类指征，对微 生物分类单元进行的描述分类。
配制蛋白胨水培养基，接种试验菌种。 培养48小时后，将一支葡萄糖蛋白胨水培养物中加入甲
基红试剂2滴，培养基若变为红色者，为阳性，变黄色 者为阴性。 取另外一支培养48小时后的葡萄糖蛋白胨水培养物，加 入5~10滴40%的KOH，然后加入等量的5%的a-萘酚溶 液，用力振荡，再放入37°温箱中保温15~30分钟，以 加快反应速度。培养物呈红色者，为V-P反应阳性。
1、淀粉水解实验 不同微生物对不同大分子的水解能
力不同，说明它们有着不同的酶系统。
淀粉遇到碘液会产生蓝色，但是细 菌水解淀粉的区域，用碘测试不再产生 蓝色，表明细菌产生淀粉酶。
2、糖发酵试验
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应 ，在肠道菌的鉴定上尤为重要。
绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源 ，但在分解糖类物质的能力上差别很大。有的能 产酸和气体，有的只产酸不产气。
发酵产酸时，溴甲酚紫（pH6.8）变为黄色 （pH5.2）。气体的产生可以由倒扣的杜氏小管 中有无气泡来证明。
3、MR（甲基红试验）
用来检测由葡萄糖产生的有机酸， 如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产 酸时，甲基红试剂会由橘黄色（6.3）变 为红色（4.2），即为甲基红阳性反应。
4、V-P VP试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生
菌体、菌落、芽孢 革兰氏染色等 糖发酵 MR、VP
技术路线：
出发菌株 形态观察 分子鉴定（16S、ITS） 理化分析 化学分析 遗传分析 菌种鉴定
第一次实验：
讨论并设计实验方案； 实验材料准备：活化培养基、发酵培养基
等； 接种：LB斜面/平板，37℃培养16~24h
活化培养基
蛋白胨：10.0g； 酵母膏：5.0 g； 氯化钠：10.0g； 琼 脂：25g； 蒸馏水：1000ml pH到 7.0。
五、参考文献（举例）
DNA G+Ｃmol% DNA 分子指纹分析 DNA-DNA杂交 核酸序列分析（16srDNA、ITS等）
（二）微生物的生理生化反应
1、淀粉水解实验 2、糖发酵试验 3、MR（甲基红） 4、V-P（伏-普）
一、目的意义
1、了解常见微生物生长曲线的测定方法 的原理特点及其适用范围
比浊法、干重法……
2、掌握比浊法测定细菌生长曲线的方法
二、材料方法
关键技术:
分类鉴定手册的使用 分类鉴定的标准流程 标准菌株参比
二、材料方法-基本原理
（一）微生物生长曲线的测定方法
多相分类法：Colwell1970年提出，指利用微生物
等分别划线接种，并在平板背面标注菌种名称。 37 ℃倒置培养24-48小时 观察各种细菌的生长情况。将平板打开盖子，滴入少量Lugol’s碘
液，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板 观察菌落周围有没有透明圈出现。透明圈和菌落的直径大小可以
初步判断菌体解淀粉的活性。
2、糖发酵试验
用记号笔在装有糖发酵培养基的试管壁上分别表明培养基名称和 所接种的细菌菌名。
传统分类是认识微生物实际重要性和研究 生物进化的基础。
2、数值分类
是随着信息数字化时代的发展，根据微生 物分类学信息，应用计算数学原理和技术辅助 定义微生物分类单元的一种方法。
主要是向分类学家提供准确的、可重复的 、大信息量的处理手段。
3、化学分类
是研究微生物细胞不同化学特性，并利用 这些特性对生物个体进行分类和鉴定。
由于细胞化学成分及分子结构的稳定性好 ，因此化学分类是原核微生物系统分类学的主 要方法之一。
3、化学分类的常用方法
细胞（壁）化学组分分ຫໍສະໝຸດ Baidu 枝菌酸分析（诺卡氏菌） 磷酸类脂分析 脂肪酸组分分析 醌组分分析 全细胞蛋白SDS-PAGE分析 核糖体蛋白双向凝胶电泳（2D-PAGE）
4、分子分类
非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。
此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧 化成二乙酰。二乙酰与蛋白质中的精氨酸的胍 基作用，生成红色化合物，即为VP试验阳性。
实验材料
1. 菌种 待鉴定菌株：分离物； 参比菌株：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等 2、培养基 3、仪器或其他用具
1. 淀粉水解试验
将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃，无菌操作制成平板。 用记号笔在平板底步划成三部分，将枯草、大肠杆菌、变形杆菌
第二次实验：
（一）接种： 将活化好的菌种接种到鉴定培养基中 按照要求进行培养。 观察记录其菌落形态、菌体形态 革兰氏染色
第三次实验：
（一）完成菌种鉴定实验
理化指标（糖发酵、明胶液化、MR、VP）
（二）菌种生长曲线试验准备
三、数据结果
四、讨论分析
分类鉴定的程序 分类鉴定指标的确定 ……
微生物学实验技术
一株产中性蛋白酶芽孢细菌的选育
实验内容
一、产中性蛋白酶芽孢细菌的初步筛选 二、产中性蛋白酶芽孢细菌的诱变育种 三、产中性蛋白酶芽孢细菌的发酵复筛 四、产中性蛋白酶芽孢细菌的分类鉴定
五、产酶菌株生长曲线的测定
六、产酶菌株的菌种保藏
实验五 产酶菌株生长曲线的测定
一、目的意义 二、材料方法 三、数据结果 四、讨论分析 五、参考文献
取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接入大肠杆菌、枯草杆菌、 普通变形杆菌，对照不接种。另取乳糖发酵培养基试管3支，操 作同上。
接种后，轻轻摇动试管使其混合均匀，防止倒置的小管进入气泡 将接过种的和作为对照的6支管均置于37℃培养24~48小时。 观察各试管颜色变化以及杜氏小管有无气泡。
4、MR、VP试验
多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育 的信息，综合研究微生物分类和系统进化的过程。多 相分类法几乎包括了现代分类中所有的方面，如传统 分类、化学分类、分子分类、数值分类等，被认为是 目前研究各级分类单元最有效的手段，可用于所有水 平上的分类单元的描述和定义。
1、传统分类法
也称描述分类，主要指以形态特征、培养 特征以及生理生化特征等表观分类指征，对微 生物分类单元进行的描述分类。
配制蛋白胨水培养基，接种试验菌种。 培养48小时后，将一支葡萄糖蛋白胨水培养物中加入甲
基红试剂2滴，培养基若变为红色者，为阳性，变黄色 者为阴性。 取另外一支培养48小时后的葡萄糖蛋白胨水培养物，加 入5~10滴40%的KOH，然后加入等量的5%的a-萘酚溶 液，用力振荡，再放入37°温箱中保温15~30分钟，以 加快反应速度。培养物呈红色者，为V-P反应阳性。
1、淀粉水解实验 不同微生物对不同大分子的水解能
力不同，说明它们有着不同的酶系统。
淀粉遇到碘液会产生蓝色，但是细 菌水解淀粉的区域，用碘测试不再产生 蓝色，表明细菌产生淀粉酶。
2、糖发酵试验
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应 ，在肠道菌的鉴定上尤为重要。
绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源 ，但在分解糖类物质的能力上差别很大。有的能 产酸和气体，有的只产酸不产气。
发酵产酸时，溴甲酚紫（pH6.8）变为黄色 （pH5.2）。气体的产生可以由倒扣的杜氏小管 中有无气泡来证明。
3、MR（甲基红试验）
用来检测由葡萄糖产生的有机酸， 如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产 酸时，甲基红试剂会由橘黄色（6.3）变 为红色（4.2），即为甲基红阳性反应。
4、V-P VP试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生
菌体、菌落、芽孢 革兰氏染色等 糖发酵 MR、VP
技术路线：
出发菌株 形态观察 分子鉴定（16S、ITS） 理化分析 化学分析 遗传分析 菌种鉴定
第一次实验：
讨论并设计实验方案； 实验材料准备：活化培养基、发酵培养基
等； 接种：LB斜面/平板，37℃培养16~24h
活化培养基
蛋白胨：10.0g； 酵母膏：5.0 g； 氯化钠：10.0g； 琼 脂：25g； 蒸馏水：1000ml pH到 7.0。
五、参考文献（举例）