细菌简单染色和革兰染色

实验二细菌的简单染色和革兰染色

一、实验目的

1、学习无菌操作技术，掌握细菌涂片的制作方法。

2、掌握细菌简单染色法和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。

3、巩固显微镜油镜的使用方法。

二、实验原理

细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电荷的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。

简单染色法就是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。

革兰氏染色法（Gram Staining）由丹麦病理学家Christian Gram于1884年创立，是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别分类为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）这两种类型。

革兰氏染色法之所以能够将细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是因为这两类菌的细胞壁结构和成分不同。一般认为革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色，再经蕃红复染就染成了红色；革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色。

虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。

三、实验器材

1、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、酵母菌、待鉴定的未知菌S1和S3。

2、仪器及其他用品：显微镜、酒精灯、打火机、接种环、载玻片、盖玻片、擦镜纸、

擦镜液、吸水纸、镜油、无菌牙签。

3、简单染液：草酸铵甲紫染液、番红染液。

4、革兰染液：草酸铵甲紫染液、革氏碘液、95%乙醇溶液、番红染液

四、实验步骤

（一）简单染色

1、载玻片的处理：从乙醇溶液中取出洗干净的载玻片，用吸水纸擦干，将要涂菌

的部位在酒精灯火焰上烤一下，去除油脂，冷却待用。

2、涂片:左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上灼烧待冷却后，用接种环从试

管枯草芽孢杆菌培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。注意在拔或塞试管塞时，应将试管口在火焰处略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。

3、干燥：涂片后室温下自然干燥。

4、固定：手持载玻片一端使标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动2~3

次，要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。固定的目的是杀死微生物，固定其细胞结构，保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉。

5、染色：在固定好的涂片标记处滴加1滴草酸铵甲紫染液，染色1min。

6、水洗：缓慢冲洗染液，吸干。

7、实验搭档改用大肠杆菌培养液和番红染液，同时操作以上步骤。

8、镜检：观察两个标本，区分辨别染成的紫色和红色。

（二）革兰染色

1、制片：分别取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、酵母菌、未知菌S1和S3

的菌液制成涂片，干燥，固定。

2、初染：滴加1滴草酸铵甲紫染液，染色1min，水洗，吸干。

3、媒染：再加1滴碘液覆盖涂片1min，水洗。

4、脱色：用吸水纸吸去玻片上的残留水，用滴管滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动

玻片直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。

5、复染：滴加蕃红染液复染3min，水洗。

6、镜检：吸干水后，盖上盖玻片观察标本，观察时注意细菌形态、大小、排列和

颜色。

（三）选做实验

在干净的载波片上滴加半滴水，用无菌牙签取一点牙垢，涂抹在水滴上，制成涂片后，进行革兰氏染色后观察。

五、实验结果与讨论

1、革兰染色照片结果（见下一页）

（1）枯草杆菌

图1 枯草杆菌革兰氏染色结果，10×100

如上图所示，枯草杆菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+）。

注：图中红色箭头所指的特殊结构——芽孢。

（2）酵母菌

图2 酵母菌革兰氏染色结果,10×100

如上图所示，酵母菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+）。

注：图中红色箭头所示为出芽现象。

（3）金黄色葡萄球菌

图3 金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果,10×100

如上图所示，金黄色葡萄球菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+）。

注：从图中可以清晰地观察到葡萄球状的细菌形态。

（4）大肠杆菌

图4 大肠杆菌革兰氏染色结果,10×100

如上图所示，大肠杆菌染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（G—）。

（5）未知菌液S1

图5 未知菌液S1涂片革兰氏染色结果,10×100

如上图所示，菌液中有两种主要的细菌。

注：红色箭头所示的未知菌的染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+），由细菌形态推测为一种杆菌；蓝色箭头所示的未知菌的染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（G—），由

细菌形态推测为一种球菌。

（6）未知菌液S3

图6 未知菌液S3涂片革兰氏染色结果,10×100

如上图所示，菌液中只有一种主要的细菌。

注：红色箭头所示的未知菌的染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（G—），由细菌形态推测为一种球菌或葡萄球菌。

（7）牙垢

图6 牙垢涂片中微生物染色结果，10×100

牙垢中含有多种细菌，多数染色为紫色，是革兰氏阳性菌（G+），如红色箭头所示为革兰氏阳性杆菌。

3、思考题

（1）分析影响某一微生物革兰染色结果的因素。

答：①菌龄：染色所用的细菌最好是出于对数生长期的细菌。因为此时细菌生长旺盛，个体数目较多，便于观察。若菌龄过大，细菌大量死亡或部分菌自然溶解，造成细胞壁通透，阳性菌出现假阴性，使得染色结果受到干扰，不准确。

②载玻片清洁：载玻片应清洁无油脂，可以在酒精等火燃上烤一下以去除油脂。

③涂片厚度：涂片厚度太薄，会使细菌过于稀少，但也不宜太厚，因为过厚会使菌体堆

积，影响观察，同时染色时可能会残留结晶紫染料，易出现假阳性。

④干燥温度：最好让细菌涂片自然干燥。如果在火焰上略加灼烧令其干燥，温度不能超

过60度，若温度太高则菌体变形。

⑤热固定温度：将已干燥的涂片在火焰上通过3-4次，温度不超过60度，以手背接触

不烫为宜。温度低则菌体固定不牢，水洗时易被冲去；温度高菌体发生变形。

⑥染色：初染色时间应控制在30s~1min为宜。如果染色时间过短, 不利于初染液结晶

紫与细胞结合,造成阳性菌呈阴性结果。而染色时间过长, 不易脱色，易使阴性菌呈假阳性。

⑦乙醇脱色：脱色时间最好在10~20s，以恰好洗脱液物色为准，如果时间过长, 革兰

阳性菌也有可能被脱色, 结果呈假阴性。而若脱色时间不足, 革兰阴性菌细胞壁的部分类脂质未被乙醇溶解,使结晶紫-碘的复合物不能被洗脱出来,结果呈假阳性。

（2）思考一下，我们平常使用的甲紫药水杀菌机理。

答：龙胆紫为碱性阳离子染料,其阳离子能与细菌蛋白质的羧基结合，从而影响其代谢，对革兰氏阳性菌有选择性抑制作用，因而产生杀菌作用。一般医用的紫药水是龙胆紫的1％～2％水溶液或酒精溶液，是常用的外用药。对革兰氏阳性菌、绿脓杆菌、及真菌（如念珠菌以及皮肤癣菌等）有较强杀菌作用，对革兰氏阴性菌和抗酸菌作用不显著。对组织无刺激性。

六、实验小结