第02章 生物制品制备的一般步骤

3.防腐剂保鲜。适应于液体原材料，如发酵液、提取液等。常
用防腐剂有乙醇、苯酚、甘油等。
二、目的产物的提取纯化
（一）组织细胞破碎 常用的方法：组织匀浆法、反复冻融、超声振荡、酶解 法、高压破碎、渗透压法、研磨等。 目的：将目标分子以可溶态充分暴露出来，并与其他成 分分开，便于后续的高效率纯化。 （二）固液分离
一般步骤：
1. 细胞（菌体）与培养基的分离。常用离心法（大量生 产可用连续离心机）。根据目的蛋白存在的部位，收集细胞 或培养基。 2. 细胞破碎。常用的方法有超声破碎、高压破碎和反复 冻融等。目的：将目标蛋白以可溶态充分暴露出来，并与其
他成分分离。若为分泌表达，本步骤可省略。
3. 粗提。将绝大多数杂质去掉的过程。方法多为离心、 盐析、有机溶剂沉淀、吸附、等电点、超滤等。
四、蛋白质提取、纯化的一般步骤
1.选材： 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。 原则：原材料来源充足；目标蛋白含量丰富；易于处理 和提取。 2.生物材料的破碎和预处理：常用的方法有组织匀浆法、
研磨、反复冻融、溶菌酶、高压破碎等。
目的：将目标蛋白以可溶态充分暴露出来，并与其他成 分分离。
3.粗分离：将绝大多数杂质去掉的过程。方法多为离心、
泳都是一个峰。末端AA测定。
活性：比活或生物活性鉴定。
6.产物的浓缩、干燥和保存。
五、重组蛋白质提取、纯化特点
与提取纯化天然蛋白质相比，重组蛋白质的提取纯化具 有以下特点： 1. 细菌、酵母、传代细胞等表达体系组成背景清楚， 用它们表达的重组蛋白的提取纯化简单、容易； 2. 分泌表达的蛋白更易提取纯化，且不被细胞内蛋白 污染，特别是利用无血清培养时。 3. 同一种蛋白质，应用不同的表达系统表达，其提取 纯化的策略可能完全不同。 4. 可根据不同的表达系统特点，设计易于提取纯化目 的蛋白的表达策略。
方法：离心、膜过滤、自然沉降。
目的：将细胞碎片或未充分破碎的组织等杂质去掉。 （三）目的产物的分离纯化 除去可溶性杂质，同时富集目的产物的过程，称之为分
离纯化。这是生物制品制备的核心。
方法：沉淀技术、离心技术、过（超）滤技术、层析技术、 萃取技术、电泳技术等，是生物制品制备的常用技术。 但应注意，生物分子千差万别，不同的目的产物，由于其 物理、化学性质不同，生物学特性迥异，因此没有一个方法适 合于任何生物制品的分离纯化
常用的沉淀方法：
1. 盐析(Salting Out) 在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体 稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫 酸铵、硫酸钠、氯化钠等。
2. 重金属盐沉淀蛋白质 蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐 沉淀，沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜。因为此时蛋白质 分子有较多的负离子，易与重金属离子结合成盐。 3. 生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质 蛋白质又可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某 些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀，沉 淀的条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电荷，易于 与酸根负离子结合成盐。
6. 蛋白质的沉淀 7. 蛋白质的变性与复性
（一）蛋白质的两性解离和等电点
当蛋白质溶液处于某一pH值时，蛋白质解离成正、 负离子的趋势相等，净电荷为“O”，此时溶液的pH值 称为该蛋白质的等电点(isoelectric point, pI)。 蛋白质溶液的pH大于等电点，该蛋白质颗粒带负 电荷，反之则带正电荷。 蛋白质分子所带电荷的性质决定了它在电场中移 动的方向。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不 移动。 人体体液中许多蛋白质的等电点在pH5.0左右，所 以在体液中以负离子形式存在。
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二、蛋白质提取、纯化的特点
与化学产品的分离制备相比较，蛋白质的制备有以下主要 特点：
⑴生物材料的组成极其复杂。所以蛋白质分子的分离纯化
方法差别极大，想找到一种适合各种蛋白质分子分离制备的标 准方法是不可能的。
⑵许多蛋白质分子在生物材料中的含量极微。
⑶许多蛋白质分子一旦离开了生物体内的环境极易失活。 ⑷蛋白质的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、
4.精制：将粗提物中的杂质进一步去除。方法主要为各种层 析技术，特别是亲和层析技术。 基因工程包涵体在纯化前，需要可逆性的变性、复性处理。 5. 鉴定：包括3方面的内容：含量；纯度；活性。贯穿于提 取、纯化的每一步。
等电聚焦电泳
（二）蛋白质的呈色反应
1. 茚三酮反应(Ninhydrin Reaction) α-氨基酸与水化茚三酮(苯丙环三酮戊烃)作用时，产生蓝色 反应。蛋白质是由许多α-氨基酸组成的，故也呈此颜色反应。 2. 双缩脲反应(Biuret Reaction) 蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，称为双缩脲 反应。凡分子中含有两个以上－CO－NH－键的化合物，都呈此 反应。 3. 米伦反应(Millon Reaction) 蛋白质溶液中加入米伦试剂(亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混 合液)，蛋白质首先沉淀，加热则变为红色沉淀。
此外，蛋白质溶液还可与酚试剂、乙醛酸试剂、浓硝酸等发 生颜色反应。
（三）蛋白质的紫外吸收
因为蛋白质中含有Tyr、Phe、Trp等芳香氨基酸，其紫 外吸收最大峰的波长为280nm。而且光吸收值（OD值）与蛋 白质的浓度程正相关。 测定蛋白质浓度的方法：标准曲线法和经验公式法。
标准曲线法:
经验公式法： 蛋白质浓度（mg/ml）= 1.45×OD280-0.74×OD260 注意：在使用该公式时，OD280 应在0.1~0.7之间，所测值才
（七）蛋白质的变性与复性
变性（denaturation）： 在变性因素的作用下，蛋白质一级结构不发生变化，空 间构象被破坏，生物学功能丧失，理化性质也发生改变的现 象。 变性蛋白质溶解度降低，粘度增加，结晶性被破坏，易 发生沉淀。 复性（Renaturation）: 在一定条件下，变性的蛋白质从伸展态恢复到折迭态， 并恢复其原来的理化性质和生物活性。 抗菌肽的提纯；RNase A的配制
盐析、有机溶剂沉淀、吸附、等电点、超滤等。
4.纯化：将粗提物中的杂质进一步去除的过程，又称为精 制。方法为各种层析技术，特别是亲和层析技术。 5.鉴定：包括3方面的内容：含量；纯度；活性。贯穿于 提取、纯化的每一步。 含量：凯氏定氮法、Folin-酚试剂法（Lowry法）和紫外
吸收法等。
纯度：生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要 求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电
工艺：制备某种生物制品的一系列技术方法的有机集成，
称之为该生物制品的制备工艺。 同样，没有一个工艺适合于所有生物制品的制备。有时， 同一种生物制品，在不同的实验室或车间也很难套用同一个生 产工艺；不同的操作者，使用同一个生产工艺，也很难达到同 样的生产效果。
第二节 蛋白类生物制品的分离纯化方法
主要内容：
第二章 生物制品制备的一般步骤
本章主要内容： 1. 生物制品制备的一般步骤
2. 蛋白类生物制品的分离纯化方法
3. 核酸类生物制品的分离纯化方法
4. 基因工程类生物制品的制备方法
第一节 生物制品制备的一般步骤
一、原材料的选择和保存方法
原材料：
人体、动物、植物、微生物及海洋生物的组织、分泌物， 以及工程细胞、细菌及人工处理（如免疫）或改造过的动、 植物。
比较准确。
（四）蛋白质的分子量
蛋白质分子大小通常用道尔顿（Dalton，Da）或千道尔顿
（kDa）表示，一般在6×103~106之间。
测定蛋白质的分子量有许多方法，常用的有SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、凝胶过滤法等。这些方法的误
差为5%~10%。
理论推算法： 蛋白质分子量（Da）= 氨基酸数目×110 Dalton: A unit of mass very nearly equal to that of a hydrogen atom. Named after John Dalton (1766–1844), who developed the atomic theory of matter.
（六）蛋白质的沉淀
蛋白质分子凝聚并从溶液中析出的现象，称为蛋白质沉
淀(precipitation)。
变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉 淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。 蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有三种稳定因素：颗粒 表面的水化层；电荷；布朗运动。 除去前两个稳定因素(如调节溶液pH至等电点和加入脱水 剂)，蛋白质便容易凝集析出。
4. 有机溶剂沉淀蛋白质 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水 的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使 蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。 例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进 行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。 5. 加热凝固 加热蛋白质溶液，可使蛋白质发生凝固(coagulation)而 沉淀。 加热首先是使蛋白质变性，有规则的空间结构被打开， 呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴 露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋 清都凝固。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
凝胶过滤法： 又称分子筛层析法
分子筛层析示意图
蛋白质洗脱体积与分子量的关系
将几种已知分子量的蛋白质混合溶液上柱洗脱，记录各种蛋白质的洗脱 体积。以分子量的对数为纵坐标，以洗脱体积为横坐标，作标准曲线。 待测蛋白质溶液在上述相同的层析条件下分离，记录其洗脱体积，然后 根据标准曲线计算其分子量。
（一）原材料选择依据和注意事项 1. 来源丰富，取材方便，价格便宜。 2. 来源清楚，质量稳定可控，最好有质量检验报告。 3. 目标成分含量高，且易于与其他成分分离。故应注意动物 的年龄、性别、生理状态，植物的生长时期（季节），微 生物的对数生长期等。
4. 由于是生物材料，故必须保持新鲜，可现用现取，或低温保 存备用，以防止腐败、变质及微生物污染。 低温保存时，应将非目标组织如动物组织中的结缔组织、 脂肪组织，细菌的培养基等尽可能去掉。 （二）原材料的保存方法 1.低温保存。短时间保存可在-20℃，欲长期保存，则应在80℃或液氮中。不得对含有活性成分的生物材料反复冻融！ 2.脱水保存。使用丙酮将原材料中的水分脱去。适应于少量价 值昂贵的原材料的保存。应注意，有机溶剂不能对活性成分 有影响。
（五）蛋白质的胶体性质
根据溶质在溶剂中的颗粒大小（分散程度），可以把分散 系统分为3类： 分散相质点小于1nm的为真溶液，大于100nm的为悬浊液， 介于l～100nm的为胶体溶液。 分散相质点在胶体系统中保持稳定，需具备3个条件： 1）分散相质点大小在l~100nm范围内，这样大小的质点在 动力学上是稳定的，介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零， 使它能在介质中不断作布朗运动（Brown movement）； 2）分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集成大 颗粒而沉淀； 3）分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层，例如与水形成水 化层（hydration mantle），质点有了水化层，相互间不易靠拢 而聚集。
一、蛋白质的理化学性质 二、蛋白质提取、纯化的特点 三、蛋白质提取、纯化前的准备 四、蛋白质提取、纯化的一般步骤 五、重组蛋白质提取、纯化的一般步骤
一、蛋白质的理化性质
共有以下7个性质：
1. 蛋白质的两性解离和等电点
2. 蛋白质的呈色反应
3. 蛋白质的紫外吸收 4. 蛋白质的分子量
5. 蛋白质的胶体性质
离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确
估计和判断，因而实验结果常有很大的经验成份，实验重复性 较差，个人的实验技术水平和经验对实验结果有较大的影响。
三、蛋白质提取、纯化前的准备
在进行蛋白质的制备前，通常需要对以下几方面的内容加
以确定或预先了解。 ①明确实验目的和要求。科研、开发，还是要发现新的物 质。 ②通过文献调研和预备性实验，掌握目的蛋白质的理化性 质和生物学特性。如分子大小；溶解度；电荷；吸附性质；热 稳定性；对配体分子的生物学亲和力等。 ③建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备蛋白质的关 键。 ④确定可能的技术路线和实验方案，这是最困难的过程， 要求具有很高的综合知识和实验技术水平。