人体红细胞叶酸含量测定方法

人体红细胞叶酸含量测定方法说明

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人体红细胞叶酸含量测定方法

(一)技术领域

本发明涉及一种人体红细胞叶酸含量测定方法，属于标志免疫学范畴。

(二)背景技术

长期以来，临床检验中一般是对人血清中叶酸含量的测定，来判断人体叶酸的缺乏与否。近年来，经研究证明红细胞中叶酸含量是血清中叶酸的含量的10～20倍，并且血清中叶酸含量由于受饮食、疾病等外来因素的影响，其浓度水平波动较大。而红细胞中叶酸含量受外界因素的干扰很少，更能真实地反映组织中叶酸的浓度水平。仅仅测定血清叶酸含量就不能满足临床医学的要求，尤其发现红细胞叶酸水平的高低对预防人口出生缺陷有非常重要的价值，测定红细胞叶酸含量的工作就有一种新的意义。

过去血清叶酸含量测定一般采用放射免疫检测方法γ-计数仪进行的。该技术(简称RIA)是将放射性同位素标记技术与抗原抗体反应结合起来的一种微量分析方法。1960年建立的经典RIA是使同位素标记的抗原和待测未标记抗原与对应的抗体作用，在抗原过量的条件下，两种抗原与抗体竞争结合，然后通过测定抗原抗体复合物和游离抗原的放射性来求得待测抗原的含量。该方法测定步骤繁琐、反应时间长、试剂稳定性差，更重要的是由于标记物是放射性同位素，对环境污染大，对人的健康有威胁，但在相当一个时期由于涉及方法学的特点，专业界只能不得已而为之。

(三)发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种灵敏度高、准确性好、没有环境污染的人体红细胞叶酸含量测定方法。

为了解决上述技术问题，本发明包括如下步骤：

(1)采集全血标本；(2)全血标本预处理：使红细胞完全破坏，使红细胞叶酸成分被完全释放出来；(3)用化学发光法测定全血的叶酸含量，(4)通过全血中叶酸的含量和已知的红细胞压积换算出红细胞中叶酸含量。

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为了使叶酸完全释放，并使叶酸不被破坏，所述步骤(2)全血标本预处理为：取容积比为20的1～1.5％的抗坏血酸溶液和全血标本混匀，室温放置1小时后备用。

为了操作简便，所述步骤(3)包含步骤有：a取微孔板，对微孔用叶酸的单克隆抗抗体进行包被；b然后在微孔内添加经预处理后的全血标本、酶标记抗原和叶酸抗体，全血标本的抗原和酶标记抗原与抗体竞相结合后，形成包被二抗-叶酸抗体-酶标记抗原复合物，添加化学发光底物使其发射光子，计数其光子数，与同条件下所测的已知量的标准抗原所得的专用标准曲线比较，计算出被检全血标本中的叶酸含量。

本发明通过化学发光法测定全血的叶酸含量，再通全血叶酸含量计算红细胞叶酸含量，本方法方法操作简单、灵敏度高、检测结果稳定，成本较低，没有环境污染(放射性污染)。完全可以取代传统的放射免疫检测方法。填补化学发光法测定红细胞叶酸含量的空白。

(四)具体实施方式

本具体实施例的人体红细胞叶酸含量测定方法包括如下步骤：

(1)采集全血标本；1.1病人必须空腹；1.2标本管需用聚乙烯塑料管。血标本必须无脂血、无溶血；1.3抗凝血标本必须以肝素(15IU/mol)抗凝；不加抗凝剂的血标本自然凝固必须彻底；1.4全血样本必须在8小时内进行试验，或者在分装后冷冻(-20℃)保存，但必须在7周内(以室温融解一次)使用。

(2)全血标本预处理：将全血标本与体积为其20倍的1～1.5％抗坏血酸溶液混匀，室温放置1小时后备用；使得红细胞完全破坏，使红细胞叶酸成分被完全释放出来；得到溶血液。

(3)用化学发光法测定全血的叶酸含量，

试剂准备：

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检测仪器：红细胞叶酸检测仪、标本前处理系统。

测定方法：(操作环境避免强光照射)

是利用48或96孔塑料微孔板，对微孔用叶酸的单克隆抗抗体进行包被，然后在微孔内添加溶血液标本、用HRP标记的已知抗原和叶酸抗体，经过抗原竞争反应结合后再添加发光底物，在酶的催化下发光底物生成激发态的中间产物，在回到基态时释放能量并发射光子。

试剂加样测定程序表单位：μl

充分振荡混匀30秒，37℃温育60分钟后，用稀释后的洗涤液洗板5次

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作出以抗体包被板上标准孔所测得的光子数据，和该标准孔所添加的标准抗原S0—S5已知的叶酸的含量，作出光子与叶酸含量的关系曲线，即为同条件下所测的已知量的标准抗原所得的专用标准曲线。

根据样品孔所测得的光子，通过专用标曲线查询对应的叶酸含量，即为所测样品的叶酸含量。

全血叶酸含量＝实测溶血液样本叶酸含量ug/ml×稀释倍数

(4)红细胞叶酸含量＝全血叶酸含量/红细胞压积％

(红细胞压积可参考血常规检查结果)

(由于血清叶酸含量很少，一般情况下都忽略不计。)

叶酸正常参考值：(各实验室应建立自己的正常参考值，下列正常值仅供参考。)

(该正常值范围系美国DPO固相非煮沸法所荐)

血清叶酸3～17ng/ml(6～39nmol/L)

全血叶酸43～295ng/ml(97～668nmol/L)

红细胞叶酸93～641ng/ml(212～1453nmol/L)

正常参考值：本实验室自己建立

本方法技术参数：

1.灵敏度：2ng/ml

2.精密性：用本方法检测低、中、高三组样品(n＝10)。

批内变异系数：CV％<3％；批间变异系数：CV％<5％

3.专用标准曲线线性：r>0.9980

4.有效期：在2～8℃贮存，有效期6个月。-- 4 --