《沉淀技术》PPT课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
•温度的影响：高离子强度溶液中，温度升高一般使β下降（温度 升高利于盐的溶解，夺取更多的水分子，使蛋白质溶解性更差）
lgS =β-ksI
14
第三章 沉淀技术
3、分段盐析
lgS =β-ksI
1. ks分段盐析：固定蛋白质的pH 、T（ β ）,变动离子强度I 达到沉淀的目的。
2. β分段盐析：在一定的离子强度下（ I ） ，改变溶液的pH、 T ，达到沉淀的目。
2. 加入饱和硫酸铵溶液法（需要量小时）。
20
第三章 沉淀技术
3.3.2 盐析的影响因素
现代生化分离技术
Separation Methods in Biochemistry
第三章 沉淀技术
2
第三章 沉淀技术
第一节 概述
3.1.1 沉淀的定义 • 沉淀是溶液中的溶质有液相变成固相析出的过程，表示一个新的
凝结相的形成过程，或由于加入沉淀剂使某些离子成为难溶化合 物而沉积的过程。 • 沉淀VS结晶，本质上同一种过程。 • 同类分子或离子以有规则排列形式析出——结晶； • 以无规则的紊乱排列形式析出——沉淀。
5
第三章 沉淀技术
第二节 沉淀方法的分类
盐析 有机溶剂沉淀 等电点沉淀 非离子多聚物沉淀 其他沉析技术。
第三章 沉淀技术
6
盐析法—蛋白质在水溶液中的溶解度受盐浓度影
1、基本原理
响
蛋白质表面特性 • 蛋白质溶解：相似者相溶 • 亲水性和疏水性：
• 有利因素：亲水性，包括氢键、极性基 团、离子化侧链、亲水蛋白所占的%等 。如白蛋白
8
第三章 沉淀技术
盐溶
原理：大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下， 酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。蛋白质分子 吸附盐类离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥（同性相斥）； 而蛋白质与水分子的相互作用却加强，溶解性增大。
9
第三章 沉淀技术
盐析 （破坏水化膜、中和电荷）
3. 无定型沉淀：颗粒最小，其直径大约在0.02 μm以下。沉淀 内部离子排列杂乱无章，并且包含有大量水分子，因而结构 疏松，体积庞大，难以沉降。
4
第三章 沉淀技术
3.1.3 沉淀技术的应用特点
• 设备简单，成本低，小批量生产。（豆腐，胶体凝聚）； • 有选择性（不同的溶剂可以沉淀出不同的成分出来）； • 沉淀剂的选择要考虑对生物活性的破坏作用和对人体的残留毒害。
1、继续增大中性盐离子强度时→大量的盐夺取了自由水，将其转 变为盐离子的水化水→蛋白质胶体外层的水化膜因盐的夺取而 遭到破坏→蛋白质胶体表面的疏水区域暴露出来，彼此相互聚 集，沉淀；
10
第三章 沉淀技术
2、加入高浓度中性盐后，盐离子与生物分子表面的带相反电荷的 离子基团结合，中和了生物分子表面的电荷，降低了生物分子 与水分子之间的相互作用，此时生物分子很容易相互聚集，在 溶液中的溶解度降得很低，从而形成沉淀从溶液中析出。
16
第三章 沉淀技术
3.2 盐的选择
通常采用中性盐，最常用（NH4）2SO4， 优点： 1、溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐 类所不具备的。 由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求 在低温下（0～4℃）进行。硫铵在0℃时的溶解度70.6g/100mL ， Na2SO4 -4.9, NaH2PO4 -1.6
• 硫酸铵使用时要求纯度较高，生产时为降低成 本，一般选用化学纯的硫酸铵，在使用前应进行 预处理，可通过化学法将重金属除去（如通入H2S 后过滤），再将硫酸铵重结晶备用。
19
第三章 沉淀技术
加盐的方法
1. 固体硫酸铵加入法（需要量大时）。将其研成细 粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，接近计 划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免 局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。
17
第三章 沉淀技术
2、不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白 质用2～3mol/L浓度的（NH4）2SO4保存可达数年之久。 3、次常用Na2SO4。缺点：在30℃以下溶解度较低，主要用于热 稳定蛋白。
18
第三章 沉淀技术
3.3 盐析的操作与应用
3.3.1 盐析的操作方法
盐的处理
3. ks分段盐析用于蛋白质粗品的分级沉淀。 4. β分段盐析用于蛋白质进一步的精细分离纯化。
15
第三章 沉淀技术
3、盐析操作要点
3.1 无机盐的挑选原则
• 高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液； • 溶解度受温度的影响小； • 盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离； • 不易引起蛋白质的变性； • 价格低廉；
11
第三章 沉淀技术
2、盐析公式及讨论
蛋白质溶解度与溶液中离子强度关系：
lgS =β-ksI S，蛋白质溶解度（g/L） I=(1/2)∑cizi2 β为常数，I=0时的lgS ks为盐析常数，与盐性质（离子价数、离子半径
等）、蛋白结构有关，ks越大，盐析效果越好（S 越小，越易沉淀）
12
第三章 沉淀技术
• 不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基 团、疏水蛋7 白所占的%等。如纤第三维章蛋沉淀白技术 原。
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH 都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包 围于蛋白质分子周围形成1nm~100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋 白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层 越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也 越大。
讨论Baidu Nhomakorabea
1、KsI项 Ks与溶液的pH、温度无关，仅取决于蛋白质的性质和盐的种
类。盐浓度↑→离子强度I↑→S↓→析出。
lgS =β-ksI
13
第三章 沉淀技术
2、β值的特性及对盐析的影响 •表示不外加盐时的理想溶解度S，肯定受到温度、pH的影响； •pH的影响：β在pI时最小（调节pH可以导致蛋白质净电荷数变 化）
3
第三章 沉淀技术
3.1.2 沉淀的类型：
1. 晶形沉淀：颗粒最大，其直径大约在0.1~1 μm之间。在沉淀 内部，离子按晶体结构有规则地进行排列，因而结构紧密， 整个沉淀所占的体积较小，极易沉降于容器底部。
2. 凝乳状沉淀：颗粒大小介于上述二者之间，其直径大约为0.0 2~1 μm，因此其性质也介于二者之间。
lgS =β-ksI
14
第三章 沉淀技术
3、分段盐析
lgS =β-ksI
1. ks分段盐析：固定蛋白质的pH 、T（ β ）,变动离子强度I 达到沉淀的目的。
2. β分段盐析：在一定的离子强度下（ I ） ，改变溶液的pH、 T ，达到沉淀的目。
2. 加入饱和硫酸铵溶液法（需要量小时）。
20
第三章 沉淀技术
3.3.2 盐析的影响因素
现代生化分离技术
Separation Methods in Biochemistry
第三章 沉淀技术
2
第三章 沉淀技术
第一节 概述
3.1.1 沉淀的定义 • 沉淀是溶液中的溶质有液相变成固相析出的过程，表示一个新的
凝结相的形成过程，或由于加入沉淀剂使某些离子成为难溶化合 物而沉积的过程。 • 沉淀VS结晶，本质上同一种过程。 • 同类分子或离子以有规则排列形式析出——结晶； • 以无规则的紊乱排列形式析出——沉淀。
5
第三章 沉淀技术
第二节 沉淀方法的分类
盐析 有机溶剂沉淀 等电点沉淀 非离子多聚物沉淀 其他沉析技术。
第三章 沉淀技术
6
盐析法—蛋白质在水溶液中的溶解度受盐浓度影
1、基本原理
响
蛋白质表面特性 • 蛋白质溶解：相似者相溶 • 亲水性和疏水性：
• 有利因素：亲水性，包括氢键、极性基 团、离子化侧链、亲水蛋白所占的%等 。如白蛋白
8
第三章 沉淀技术
盐溶
原理：大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下， 酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。蛋白质分子 吸附盐类离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥（同性相斥）； 而蛋白质与水分子的相互作用却加强，溶解性增大。
9
第三章 沉淀技术
盐析 （破坏水化膜、中和电荷）
3. 无定型沉淀：颗粒最小，其直径大约在0.02 μm以下。沉淀 内部离子排列杂乱无章，并且包含有大量水分子，因而结构 疏松，体积庞大，难以沉降。
4
第三章 沉淀技术
3.1.3 沉淀技术的应用特点
• 设备简单，成本低，小批量生产。（豆腐，胶体凝聚）； • 有选择性（不同的溶剂可以沉淀出不同的成分出来）； • 沉淀剂的选择要考虑对生物活性的破坏作用和对人体的残留毒害。
1、继续增大中性盐离子强度时→大量的盐夺取了自由水，将其转 变为盐离子的水化水→蛋白质胶体外层的水化膜因盐的夺取而 遭到破坏→蛋白质胶体表面的疏水区域暴露出来，彼此相互聚 集，沉淀；
10
第三章 沉淀技术
2、加入高浓度中性盐后，盐离子与生物分子表面的带相反电荷的 离子基团结合，中和了生物分子表面的电荷，降低了生物分子 与水分子之间的相互作用，此时生物分子很容易相互聚集，在 溶液中的溶解度降得很低，从而形成沉淀从溶液中析出。
16
第三章 沉淀技术
3.2 盐的选择
通常采用中性盐，最常用（NH4）2SO4， 优点： 1、溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐 类所不具备的。 由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求 在低温下（0～4℃）进行。硫铵在0℃时的溶解度70.6g/100mL ， Na2SO4 -4.9, NaH2PO4 -1.6
• 硫酸铵使用时要求纯度较高，生产时为降低成 本，一般选用化学纯的硫酸铵，在使用前应进行 预处理，可通过化学法将重金属除去（如通入H2S 后过滤），再将硫酸铵重结晶备用。
19
第三章 沉淀技术
加盐的方法
1. 固体硫酸铵加入法（需要量大时）。将其研成细 粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，接近计 划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免 局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。
17
第三章 沉淀技术
2、不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白 质用2～3mol/L浓度的（NH4）2SO4保存可达数年之久。 3、次常用Na2SO4。缺点：在30℃以下溶解度较低，主要用于热 稳定蛋白。
18
第三章 沉淀技术
3.3 盐析的操作与应用
3.3.1 盐析的操作方法
盐的处理
3. ks分段盐析用于蛋白质粗品的分级沉淀。 4. β分段盐析用于蛋白质进一步的精细分离纯化。
15
第三章 沉淀技术
3、盐析操作要点
3.1 无机盐的挑选原则
• 高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液； • 溶解度受温度的影响小； • 盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离； • 不易引起蛋白质的变性； • 价格低廉；
11
第三章 沉淀技术
2、盐析公式及讨论
蛋白质溶解度与溶液中离子强度关系：
lgS =β-ksI S，蛋白质溶解度（g/L） I=(1/2)∑cizi2 β为常数，I=0时的lgS ks为盐析常数，与盐性质（离子价数、离子半径
等）、蛋白结构有关，ks越大，盐析效果越好（S 越小，越易沉淀）
12
第三章 沉淀技术
• 不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基 团、疏水蛋7 白所占的%等。如纤第三维章蛋沉淀白技术 原。
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH 都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包 围于蛋白质分子周围形成1nm~100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋 白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层 越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也 越大。
讨论Baidu Nhomakorabea
1、KsI项 Ks与溶液的pH、温度无关，仅取决于蛋白质的性质和盐的种
类。盐浓度↑→离子强度I↑→S↓→析出。
lgS =β-ksI
13
第三章 沉淀技术
2、β值的特性及对盐析的影响 •表示不外加盐时的理想溶解度S，肯定受到温度、pH的影响； •pH的影响：β在pI时最小（调节pH可以导致蛋白质净电荷数变 化）
3
第三章 沉淀技术
3.1.2 沉淀的类型：
1. 晶形沉淀：颗粒最大，其直径大约在0.1~1 μm之间。在沉淀 内部，离子按晶体结构有规则地进行排列，因而结构紧密， 整个沉淀所占的体积较小，极易沉降于容器底部。
2. 凝乳状沉淀：颗粒大小介于上述二者之间，其直径大约为0.0 2~1 μm，因此其性质也介于二者之间。