胚胎工程学

第一章胚胎移植

胚胎移植：又名借腹怀胎，受精卵移植，它是指将良种母畜的早期胚胎取出，移植到同种和生殖状态相同的母畜体内，使之继续发育成新个体的过程.

供体：提供胚胎的母畜受体: 接受胚胎的母畜

1.胚胎移植的意义:①充分利用母畜的繁殖力②加速引进优良品种的繁殖，家畜改良进程和新品的培育③增加肉用畜种的双胎率④降低费用，减少疾病传播⑤克服母畜不孕症⑥胚胎工程的技术基础.

2.胚胎移植的生理学基础:A.母畜发情后生殖器官的孕向发育B.早期胚胎的游离状态C.胚胎移植不存在免疫问题D.遗传本质不变.

3.胚胎移植的基本原则:A.移植前后所处环境的同步性B.胚胎发育的期限和质量.

4．胚胎移植的条件:A.可靠的胚胎来源B.良好的技术条件C.足量的生理状态，良好的受体D.静洁的实验室和简便实用的操作设备.

5．胚胎移植的技术程序:A.供体母畜和受体母畜的选择与饲养管理 B.供体母畜的超级排卵处理 C.供体的配种或人工受精D.受体母畜的同期发情处理E.胚胎的采集F.胚胎的检查与鉴定G.胚胎的保存H.胚胎的移植J.供受体的术后观察.

6羊胚胎移植的关键技术：A．供体羊要求：纯种，繁殖正常，2-3产，中等膘情B。受体羊要求：繁殖正常的2-3产本地母羊，中等膘情C．供体超排数和配种：放CID尺栓当天为0天，在第13天开始注射FSH，每次间隔12h，三天注射6次，减量注射。最后一针FSH后，撤CID尺栓，并注射0.8-1.0mlPG。撤栓后第二天开始发情，第一次配种后注射与FSH相当剂量的LH，以后每8h配种一次，直到手术D．受体同期发情供体放CID尺后，可以间隔9天两次PG，在第二次PG后24h后进入发情旺盛期，正好与供体同步，FSH减量注射:1.5 1.0 0.E．冲胚时间：子宫冲胚法在配种后3-5天冲胚，输卵管冲胚在60-70h冲胚F．手术前准备：供体羊与受体羊要事先按照发情先后分组，同期的放在同一组，用不同颜色的喷漆标号，手术后24h禁食，手术部位刮毛清洗。手术间升温到25°C以上，并彻底消毒，准备好保定架、药品、器械等。G．手术：供体羊用麻药，受体不用麻不用麻药。供体与受体在手术中要严格杜绝出血，以防粘连（黄体）H．术后管理：供体手术后第一个情期（绵羊17天，山羊21天）要配种，受体羊精心管理，在第3个情期试情后没有返情者认定妊妊娠。

8．影响胚胎移植效果的因素：A．胚胎因素：胚胎质量、胚龄、鲜、胚与冻胚、胚的分割；B．受体因素：受体动物的选择，营养及管理、受供体的周期化程度、供体中的黄体发育

9．胚胎移植存在的问题主要是移植成功的总体效率低，成本高

第二章体外受精

一．体外受精（in vitro fertilization，IVF）是指通过人为操作使精子和卵子在体外环境中完成受精过程的胚胎工程技术。在生物学领域中，将IVF的胚胎移植后所获得的后代称为试管动物。

二．体外受精的意义：（1）可望得到大量质优、价廉的体外生产胚胎，充分挖掘母畜的繁殖潜力；（2）观察配子发育、成熟受精及胚胎发育等一系列现象，为探索配子发育调控机理等受精生物学积累资料；（3）可评定家畜精子的质量，了解精子受精的潜力，防治不孕症（利用睾丸中球形精子细胞作带下或胞质内受精）和母畜的输卵管阻塞等。（4）将体外受精技术与其它生物技术（如转基因技术、细胞核移植技术、基因敲除和基因修饰技术等生物高新技术）相结合，必将使优良种畜的扩繁进程呈现出崭新的发展面貌。三．体外受精的技术程序

（一）卵母细胞体外成熟：

1、牛羊卵母细胞的采集：屠宰场采集牛羊卵巢，灭菌生理盐水清洗后，迅速放入含有青链霉素的无菌生理盐水中，保温瓶温度为23-28℃，6h之内运回实验室。卵巢运回实验室后，无菌生理盐水冲洗三次，转入无菌操作室，剪去卵巢表面的结缔组织、脂肪、卵巢系膜和附着的输卵管，再用无菌生理盐水清洗三次，浸泡在38℃生理盐水中备用。

牛羊卵母细胞的采集分别采用抽吸法和切割法，采集卵巢表面2-8mm卵泡的卵泡液，卵泡液注入PBS液的检胚皿中，恒温静置一段时间，体视镜镜检COCs。

2、卵母细胞的级别

A级：由5层以上致密卵丘细胞包被的卵母细胞；

B级：由2-4层卵丘细胞基本包被的卵母细胞；

C级：卵丘细胞松散或不完全包被的卵母细胞；

D级：仅有少量卵丘细胞存在或裸露的卵母细胞；

E级：卵丘细胞已经完全扩展呈蜘蛛网状，卵母细胞胞质不均一，处于退化状态的卵母细胞。

不同级别的卵母细胞体外成熟率、受精率差异很大，现在一般选用A、B类卵母细胞做体外培养

3、卵母细胞体外成熟培养条件：培养温度：38.5℃；培养湿度：95%-100%；气体环境：5% CO2的空气；培养时间：23-24h ；培养方法：微滴培养法与U型皿培养法。

4、卵母细胞体外成熟培养液：

基础成熟液（OM）：以Hepes或NaHCO3缓冲的TCM-199为液；

常用添加成分：卵泡液、血清、激素（FSH，LH，17 -E2）、生长因子（TGF- 1，EGF ）和颗粒细胞等；添加以上成分可以改善体外培养条件，显著提高卵母细胞成熟率，保证较高受精率和囊胚率。

5、卵母细胞体外成熟的特征：A．卵母细胞的核成熟以第一极体排出为标志；B．卵母细胞的胞质成熟以卵丘细胞高度扩展为标志；C．透明带上的精子受体（ZPl、ZP2、ZP3）发生重排，透明带结构变软。（二）、成熟卵母细胞体外受精：

1、精液解冻：

细管冷冻精液从液氮罐中储精桶中拿出后，在37℃水浴迅速解冻，在最短的时间突破冰晶期，然后采集少许精液镜检精子活力。

精子洗涤液置于离心管中，预先在CO2培养箱中平衡过2h以上。

活力良好的解冻精液注入平衡好的洗涤液离心管底部，在CO2培养箱内倾斜45 静置上浮30-60min。

静置后，离心管底部活力强的精子上游至上层液中，称为精子上浮。

吸取离心管上层富含高活力精子的洗涤液2mL，注入另一无菌离心管，再加入2mL洗涤液，于离心机1500rpm 离心7-8min，弃掉上清液，吸取离心管底部高浓度精子洗涤液备用。

2、精子洗涤与上浮：

活力良好的解冻精液注入在CO2培养箱中平衡过2h以上的BO液离心管底部，在CO2培养箱内倾斜45 静置上浮30-60min。离心管底部活力强的精子上游至上层BO液中，吸取离心管上层含有精子的BO液2mL，注入另一无菌离心管，再加入2mL BO液，1500rpm离心7-8min，弃掉上清液，吸取离心管底部高浓度精子洗涤液备用。

3、精子获能：

经上浮筛选的精子移入新的受精液BO液，置于CO2培养箱孵育15min，使其获能。

卵母细胞预处理：挑选A、B级卵母细胞移入平衡过的PBS液和BO液各清洗3次，洗涤好的成熟卵母细胞连同BO液用吸管转移到一次性塑料平皿中，50 l微滴培养，每滴含10个左右卵母细胞，做好微滴后上盖石蜡油。用细嘴吸管吸取经获能处理的精液，注入卵母细胞微滴中进行体外受精。

目前一般体外受精时间为18－24h。

4、 IVM 卵母细胞体外受精：a. 去除卵丘的卵母细胞IVF b. 成熟卵母细胞 IVF c.荧光下的体外受精 d 成熟卵母细胞体外受精扫描电镜照片e IVF后卵母细胞正在排出第二极体 f IVF后卵母细胞排出第二极体

5、受精卵鉴定

（三）成熟卵母细胞孤雌激活：1.成熟卵母细胞可以被精子激活，也可以在其它因素刺激下被激活，恢复减数分裂，排出第二极体，实现卵裂，卵母细胞非受精激活称孤雌激活。2.引起孤雌激活的因素：A.物理激活包括：机械刺激、温度刺激、电场刺激。B.生化激活包括： Ca2+载体、离子霉素（Ionomycin）、 6-DMAP、放线菌酮（CHX）、酶、二价阳离子、乙醇、1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）等。这些刺激因素主要通过引起胞质内Ca2+浓度升高和MPF失活而导致卵母细胞激活.

四、卵母细胞体外成熟的影响因素：（一）卵母细胞的来源 1. 动物种类和性机能所处的阶段 2 动物年龄

3. 卵巢运输的时间（二）卵母细胞的质量 1.卵母细胞的类型 2卵泡的直径和卵丘细胞（三）培养的条件 1 温度和时间：一般为37~39℃，牛羊24~26h，猪42~48h 2气相:a .5%CO2 95%空气和饱和温度b．5%CO2 5%O290%N2和饱和温度 3 卵母细胞体外成熟培养的基础配养基（四）其他添加成分 1 激素类：FSH LH 雌激素绒毛膜促进激素 2 多肽生长因子 3 血清 4 卵泡液 5 颗粒/卵丘细胞

五、体外受精存在的问题和发展前景

（一）1 牛：利用体外生产，可为核移植技术提供具体卵裂球和受体卵母细胞； 2 绵羊：卵裂率为50%~70%,桑葚胚及囊胚发育率为30%~40%；3 山羊：1985年获得第一只试管山羊，但1994年才真正获得体外成熟培养卵母细胞，卵裂率为80.4%，桑葚胚的发育率为49%；4 猪：主要问题是多精子受精，高达60%~100%，卵黄膜阻止精子力差，可通过加入猪的卵泡液或寡糖肽来阻止；总之，有的已走向或开始走向商业化，但