水稻颖壳退化突变体的遗传分析与基因定位
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近年来, 人们在禾本科的水稻、玉米等作物中鉴定
本研究由国家高技术研究发展计划(863 计划)项目(2011AA10A100), 国家自然科学基金项目(31071390)和中央高校基本科研业务费专 项资金(XDJK2012A001)资助。 * 通讯作者(Corresponding author): 何光华, E-mail: hegh@swu.edu.cn 第一作者联系方式: E-mail: guoshuang16@163.com(郭爽); tanhua.li@163.com(李云峰) **同等贡献(Contributed equally to this work) Received(收稿日期): 2012-10-31; Accepted(接受日期): 2013-01-15; Published online(网络出版日期): 2013-02-19.
水稻颖壳退化突变体 degraded hull 2 (dh2)的遗传分析与基因定位
郭 爽** 李云峰** 任德勇 张天泉 何光华*
西南大学水稻研究所 / 转基因植物与安全控制重庆市重点实验室, 重庆 400716
摘 要: 鉴定和克隆水稻花器官突变体新基因, 对了解水稻花器官发育的分子遗传机制和分子信号调控途径有重要 作用。本研究报道了 1 个水稻颖壳异常突变体, 来源于 EMS (ethyl methane sulfonate)处理的缙恢 10 号(Oryza sativa) 诱变群体, 暂被命名为 degraded hull 2 (dh2)。表型分析发现突变体小花第 1 轮内稃或外稃横向细胞数目减少, 导致 内稃或外稃变窄而不能正常勾合, 从而呈现开裂现象, 其内 3 轮花器官均无明显变化。遗传分析表明该突变性状受 1 个隐性单基因控制。利用群体分离分析法(bulked segregation analysis, BSA), 将 DH2 基因定位在第 3 染色体的 IND-5 和 IND-14 之间, 遗传距离分别为 0.99 cM 和 1.49 cM。该研究结果为 DH2 基因的图位克隆奠定了基础。 关键词: 水稻; degraded hull 2 (dh2); 遗传分析; 基因定位
单子叶植物的花器官与双子叶植物存在较大差 异, 其发育调控机制的异同一直吸引着许多科学家 的注意。水稻被认为是单子叶的模式植物, 其花器 官由外向内由 1 对稃片(内稃和外稃)、1 对浆片、6 枚雄蕊和 1 个雌蕊构成。就形态与功能而言, 内轮 花器官雄蕊和雌蕊与双子叶植物类似, 而外轮花器 官内外稃、浆片与双子叶植物的花萼、花瓣相比都 存在明显的差异。
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130219.1019.002.html
1040
作物学报
第 39 卷
了一系列的 ABCE 类基因, 发现调控内轮花器官(雄 蕊和雌蕊) 特征的 BC 基因表现出较高的保守性, 而 决定外轮花器官的 AE 基因则出现较大的分化[6-8]。在 拟南芥中, A 类基因 AP1 和 AP2 的突变导致花萼被 转 化 成 叶 状 的 苞 片 [2,9-11], 而 E 功 能 基 因 SEPALATA1/2/3/4 冗余地调控花萼的特征发育[3]。水 稻中有 3 个 AP1 的直系同源基因 OsMADS14、 OsMADS15、OsMADS18 和 5 个 SEPALATA 类基因 OsMADS1 、 OsMADS5 、 OsMADS7 、 OsMADS8 和 OsMADS34, 然而其中只有 OsMADS15 和 OsMADS1 参与了外稃和内稃的特征发育调控。目前, 水稻等 单子叶植物外轮花器官的特征发育调控机制仍然不 清楚。
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(6): 1039−1044 ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
http://www.chinacrops.org/zwxb/ E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01039
在同一块实验田的相邻位置种植 40 株 dh2 突变 体和 40 株野生型, 在成熟期随机各选 10 株, 测量和
统计其株高、每穗粒数、每穗实粒数、结实率、千 粒重等相关农艺性状。 1.4 基因定位
采用 BSA 法定位目标基因[13], 即根据 F2 植株 表型, 分别选取 10 株正常单株和 10 株突变单株, 剪 取等量叶片, 构成正常基因池和突变基因池。按 CTAB 法提取亲本和基因池 DNA[14], 按碱煮法提取 F2 群 体 DNA[15] 。 参 照 http://www.gramene.org/ microsat/公布的 SSR 引物和 IN/DEL 引物序列, 并由 上海英骏技术公司合成。PCR 总体系为 12.6 μL, 含 1.25 μL 10×PCR buffer、1 μL 50 ng μL−1 DNA 模板、 0.75 μL 25 mmol L−1 MgCl2、0.5 μL 2.5 mmol L−1 dNTPs、8.0 μL ddH2O、1.0 μL 10 μmol L−1 引物、 0.1 μL 5 U μL−1 Taq 酶。PCR 程序为: 94℃预变性 5 min; 94℃变性 30 s, 55℃退火 30 s, 72℃复性 1 min, 35 个循环; 72℃延伸 10 min。PCR 产物经 10%非变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 快速银染后观察[15-16]。 1.5 图谱构建
Rice Research Institute / Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops, Southwest University, ChongqinΒιβλιοθήκη Baidu 400716, China
护颖(退化的苞片)、1 对护颖(退化的侧生小花, 即不 育外稃)和 1 个正常的顶生小花构成, 它们依次着生 在小穗轴上。其中顶生小花又由 4 轮花器官组成, 第 1 轮是闭合在一起的外稃和内稃, 其中内稃有 2 个特 异的边缘结构, 其细胞结构与内稃的主体部分及外 稃明显不同; 第 2 轮是 2 枚浆片, 均着生于外稃一侧; 第 3 轮是 6 枚雄蕊; 第 4 轮是 1 枚雌蕊, 雌蕊上着生 2 个柱头, 雌蕊位于小花的中心, 雄蕊着生在雌蕊 周围(图 1-A, D)。
本研究报道的 dh2 突变体主要表现为内外稃的 退化, 而内 3 轮器官无明显异常, 这种表型与以往 报道的内外稃相关突变体都不一致。我们将 DH2 基 因初步定位在第 3 染色体的 InDel 标记 IND-5 和 IND-14 之间, 遗传距离分别为 0.99 cM 和 1.49 cM, 定位区域内没有发现已知的花器官发育调控基因。 该研究结果为 DH2 基因的图位克隆奠定了基础。
用 Mapmaker3.0 软件进行突变位点与标记间的 连锁分析[17]。用 Kosambi 函数将重组率转化为遗传 距离[18]。根据 Gramene 网站(http://www.gramene.org/) 提供的水稻基因组序列信息构建物理图谱。
2 结果与分析
2.1 dh2 突变体的形态学和组织学分析 在正常情况下, 1 个野生型水稻的小穗由 1 对副
在开花期, 随机选取 100 朵 dh2 小花和野生型 小花观察其形态并用 NIKON SMZ1500 体视镜分析 其表型特征。参照 Xiao 等[12]的方法并加以改进, 选 取抽穗期的野生型和突变体小穗于 FAA (50%无水 乙醇, 0.9 mol L−1 的冰乙酸和 3.7%甲醛)中 4℃固定, 固定后迅速抽气, 在 4℃条件下过夜, 然后用 10%的 氢氟酸在黑暗条件下软化处理 1 周, 经乙醇梯度脱 水和二甲苯透明后用石蜡包埋。切片厚度为 10 µm, 经 1%番红和 1%固绿对染后于尼康 E600 光学显微 镜下观察照相分析。 1.3 农艺性状调查
Genetic Analysis and Gene Mapping of a degraded hull 2 (dh2) Mutant in Rice (Oryza sativa)
GUO Shuang**, LI Yun-Feng**, REN De-Yong, ZHANG Tian-Quan, and HE Guang-Hua*
1 材料与方法
1.1 试验材料 dh2 来源于 EMS 化学诱变的恢复系缙恢 10 号,
经过多代自交观察, 其突变性状遗传稳定。2011 年, 将小穗发育正常的材料日本晴与 dh2 杂交, 收获 F1 种子。同年, 种植于海南并收获 F2 种子。2012 年, 在 西南大学歇马水稻所研究基地种植 F2 群体, 用于定 位 DH2 基因。 1.2 形态学和组织学分析及统计
Abstract: The identification and cloning of novel mutant genes of floral organ in rice play an important role in understanding the molecular genetic mechanisms and molecular signal pathways regulating floral organ development. A rice mutant, degraded hull 2 (dh2), which was derived from ethylmethane sulfonate (EMS)-treated Jinhui 10 (Oryza sativa), exhibited defects in hull development. The dh2 florets displayed open hull in whorl 1, however, the rest floral parts in other three whorls had no obvious change. Further analysis indicated that the number of transverse cells decreased, making the lemma or palea narrow, and causing the hull open. The genetic analysis revealed that the dh2 trait is controlled by a single recessive gene. Using the BSA method, the DH2 gene was finally mapped between IND-5 and IND-14 on chromosome 3 with genetic distances of 0.99 cM and 1.49 cM, respectively. These results are useful for the map-based cloning of DH2 gene. Keywords: Rice (Oryza sativa); degraded hull 2 (dh2); Genetic analysis; Gene mapping
通过对模式植物拟南芥及金鱼草的广泛研究,
双子叶花器官发育的分子遗传学机制取得了长足的 进展, 提出了经典的花发育 ABCE 模型[1-5]。该模型 认为花器官特征发育主要受 A、B、C 和 E 四类花器 官特征基因的组合调控, 4 轮结构即花萼、花瓣、雄 蕊及心皮分别由 A+E、A+B+E、B+C+E 及 C+E 共 4 组基因决定, 每一类基因都调控两轮或两轮以上的 花器官, 其中任何一类基因的突变都会引起相应轮 次器官的同源异型转变[2,5]。
本研究由国家高技术研究发展计划(863 计划)项目(2011AA10A100), 国家自然科学基金项目(31071390)和中央高校基本科研业务费专 项资金(XDJK2012A001)资助。 * 通讯作者(Corresponding author): 何光华, E-mail: hegh@swu.edu.cn 第一作者联系方式: E-mail: guoshuang16@163.com(郭爽); tanhua.li@163.com(李云峰) **同等贡献(Contributed equally to this work) Received(收稿日期): 2012-10-31; Accepted(接受日期): 2013-01-15; Published online(网络出版日期): 2013-02-19.
水稻颖壳退化突变体 degraded hull 2 (dh2)的遗传分析与基因定位
郭 爽** 李云峰** 任德勇 张天泉 何光华*
西南大学水稻研究所 / 转基因植物与安全控制重庆市重点实验室, 重庆 400716
摘 要: 鉴定和克隆水稻花器官突变体新基因, 对了解水稻花器官发育的分子遗传机制和分子信号调控途径有重要 作用。本研究报道了 1 个水稻颖壳异常突变体, 来源于 EMS (ethyl methane sulfonate)处理的缙恢 10 号(Oryza sativa) 诱变群体, 暂被命名为 degraded hull 2 (dh2)。表型分析发现突变体小花第 1 轮内稃或外稃横向细胞数目减少, 导致 内稃或外稃变窄而不能正常勾合, 从而呈现开裂现象, 其内 3 轮花器官均无明显变化。遗传分析表明该突变性状受 1 个隐性单基因控制。利用群体分离分析法(bulked segregation analysis, BSA), 将 DH2 基因定位在第 3 染色体的 IND-5 和 IND-14 之间, 遗传距离分别为 0.99 cM 和 1.49 cM。该研究结果为 DH2 基因的图位克隆奠定了基础。 关键词: 水稻; degraded hull 2 (dh2); 遗传分析; 基因定位
单子叶植物的花器官与双子叶植物存在较大差 异, 其发育调控机制的异同一直吸引着许多科学家 的注意。水稻被认为是单子叶的模式植物, 其花器 官由外向内由 1 对稃片(内稃和外稃)、1 对浆片、6 枚雄蕊和 1 个雌蕊构成。就形态与功能而言, 内轮 花器官雄蕊和雌蕊与双子叶植物类似, 而外轮花器 官内外稃、浆片与双子叶植物的花萼、花瓣相比都 存在明显的差异。
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130219.1019.002.html
1040
作物学报
第 39 卷
了一系列的 ABCE 类基因, 发现调控内轮花器官(雄 蕊和雌蕊) 特征的 BC 基因表现出较高的保守性, 而 决定外轮花器官的 AE 基因则出现较大的分化[6-8]。在 拟南芥中, A 类基因 AP1 和 AP2 的突变导致花萼被 转 化 成 叶 状 的 苞 片 [2,9-11], 而 E 功 能 基 因 SEPALATA1/2/3/4 冗余地调控花萼的特征发育[3]。水 稻中有 3 个 AP1 的直系同源基因 OsMADS14、 OsMADS15、OsMADS18 和 5 个 SEPALATA 类基因 OsMADS1 、 OsMADS5 、 OsMADS7 、 OsMADS8 和 OsMADS34, 然而其中只有 OsMADS15 和 OsMADS1 参与了外稃和内稃的特征发育调控。目前, 水稻等 单子叶植物外轮花器官的特征发育调控机制仍然不 清楚。
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(6): 1039−1044 ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
http://www.chinacrops.org/zwxb/ E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01039
在同一块实验田的相邻位置种植 40 株 dh2 突变 体和 40 株野生型, 在成熟期随机各选 10 株, 测量和
统计其株高、每穗粒数、每穗实粒数、结实率、千 粒重等相关农艺性状。 1.4 基因定位
采用 BSA 法定位目标基因[13], 即根据 F2 植株 表型, 分别选取 10 株正常单株和 10 株突变单株, 剪 取等量叶片, 构成正常基因池和突变基因池。按 CTAB 法提取亲本和基因池 DNA[14], 按碱煮法提取 F2 群 体 DNA[15] 。 参 照 http://www.gramene.org/ microsat/公布的 SSR 引物和 IN/DEL 引物序列, 并由 上海英骏技术公司合成。PCR 总体系为 12.6 μL, 含 1.25 μL 10×PCR buffer、1 μL 50 ng μL−1 DNA 模板、 0.75 μL 25 mmol L−1 MgCl2、0.5 μL 2.5 mmol L−1 dNTPs、8.0 μL ddH2O、1.0 μL 10 μmol L−1 引物、 0.1 μL 5 U μL−1 Taq 酶。PCR 程序为: 94℃预变性 5 min; 94℃变性 30 s, 55℃退火 30 s, 72℃复性 1 min, 35 个循环; 72℃延伸 10 min。PCR 产物经 10%非变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 快速银染后观察[15-16]。 1.5 图谱构建
Rice Research Institute / Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops, Southwest University, ChongqinΒιβλιοθήκη Baidu 400716, China
护颖(退化的苞片)、1 对护颖(退化的侧生小花, 即不 育外稃)和 1 个正常的顶生小花构成, 它们依次着生 在小穗轴上。其中顶生小花又由 4 轮花器官组成, 第 1 轮是闭合在一起的外稃和内稃, 其中内稃有 2 个特 异的边缘结构, 其细胞结构与内稃的主体部分及外 稃明显不同; 第 2 轮是 2 枚浆片, 均着生于外稃一侧; 第 3 轮是 6 枚雄蕊; 第 4 轮是 1 枚雌蕊, 雌蕊上着生 2 个柱头, 雌蕊位于小花的中心, 雄蕊着生在雌蕊 周围(图 1-A, D)。
本研究报道的 dh2 突变体主要表现为内外稃的 退化, 而内 3 轮器官无明显异常, 这种表型与以往 报道的内外稃相关突变体都不一致。我们将 DH2 基 因初步定位在第 3 染色体的 InDel 标记 IND-5 和 IND-14 之间, 遗传距离分别为 0.99 cM 和 1.49 cM, 定位区域内没有发现已知的花器官发育调控基因。 该研究结果为 DH2 基因的图位克隆奠定了基础。
用 Mapmaker3.0 软件进行突变位点与标记间的 连锁分析[17]。用 Kosambi 函数将重组率转化为遗传 距离[18]。根据 Gramene 网站(http://www.gramene.org/) 提供的水稻基因组序列信息构建物理图谱。
2 结果与分析
2.1 dh2 突变体的形态学和组织学分析 在正常情况下, 1 个野生型水稻的小穗由 1 对副
在开花期, 随机选取 100 朵 dh2 小花和野生型 小花观察其形态并用 NIKON SMZ1500 体视镜分析 其表型特征。参照 Xiao 等[12]的方法并加以改进, 选 取抽穗期的野生型和突变体小穗于 FAA (50%无水 乙醇, 0.9 mol L−1 的冰乙酸和 3.7%甲醛)中 4℃固定, 固定后迅速抽气, 在 4℃条件下过夜, 然后用 10%的 氢氟酸在黑暗条件下软化处理 1 周, 经乙醇梯度脱 水和二甲苯透明后用石蜡包埋。切片厚度为 10 µm, 经 1%番红和 1%固绿对染后于尼康 E600 光学显微 镜下观察照相分析。 1.3 农艺性状调查
Genetic Analysis and Gene Mapping of a degraded hull 2 (dh2) Mutant in Rice (Oryza sativa)
GUO Shuang**, LI Yun-Feng**, REN De-Yong, ZHANG Tian-Quan, and HE Guang-Hua*
1 材料与方法
1.1 试验材料 dh2 来源于 EMS 化学诱变的恢复系缙恢 10 号,
经过多代自交观察, 其突变性状遗传稳定。2011 年, 将小穗发育正常的材料日本晴与 dh2 杂交, 收获 F1 种子。同年, 种植于海南并收获 F2 种子。2012 年, 在 西南大学歇马水稻所研究基地种植 F2 群体, 用于定 位 DH2 基因。 1.2 形态学和组织学分析及统计
Abstract: The identification and cloning of novel mutant genes of floral organ in rice play an important role in understanding the molecular genetic mechanisms and molecular signal pathways regulating floral organ development. A rice mutant, degraded hull 2 (dh2), which was derived from ethylmethane sulfonate (EMS)-treated Jinhui 10 (Oryza sativa), exhibited defects in hull development. The dh2 florets displayed open hull in whorl 1, however, the rest floral parts in other three whorls had no obvious change. Further analysis indicated that the number of transverse cells decreased, making the lemma or palea narrow, and causing the hull open. The genetic analysis revealed that the dh2 trait is controlled by a single recessive gene. Using the BSA method, the DH2 gene was finally mapped between IND-5 and IND-14 on chromosome 3 with genetic distances of 0.99 cM and 1.49 cM, respectively. These results are useful for the map-based cloning of DH2 gene. Keywords: Rice (Oryza sativa); degraded hull 2 (dh2); Genetic analysis; Gene mapping
通过对模式植物拟南芥及金鱼草的广泛研究,
双子叶花器官发育的分子遗传学机制取得了长足的 进展, 提出了经典的花发育 ABCE 模型[1-5]。该模型 认为花器官特征发育主要受 A、B、C 和 E 四类花器 官特征基因的组合调控, 4 轮结构即花萼、花瓣、雄 蕊及心皮分别由 A+E、A+B+E、B+C+E 及 C+E 共 4 组基因决定, 每一类基因都调控两轮或两轮以上的 花器官, 其中任何一类基因的突变都会引起相应轮 次器官的同源异型转变[2,5]。