癌胚抗原的时间分辨免疫荧光分析及其诊断试剂的研制

HANG J ian-feng1 , WU Y ing-song1, YU Wei-hong2, HUANG Y ing3 , L IM ing1*
1 Schoo l of B iotechno logy, Sou thern M ed ica l U niversity, G uangzhou 510515;2G uangzhou D a rui antibody Co. , L td. , G uang zhou
CEA-TRF IA and comme rc ia lly ava ilab le CEA CL IA(chem ilum inescent mi munoa ssay) k it(Roche) w as 0. 946. CONCLU SIO N:CEA-TRFIA is a new mi munoassay wh ich has seve ra l advantage s includ ing h igh sens itivity, spec ificity and a w ide w orking range. It is su itab le for rou tine c lin ica l u se. [ K eyw ords] ca rc ino-emb ryon ic an tigen ( CEA); tmi e-re-
逐渐代替了定性检测而被广大临床医师所接受 。血 清癌胚抗原 (CEA)为一 种传统的广谱肿 瘤标志物 , 其结构为一种复杂的可溶性糖蛋白 [ 1] 。 CEA 于 1965 年由 G o ld和 F reedm an首先从胎儿及结肠癌组织中发 现 , 相对分子质量 (M r)约为 220 000, 主要存在于胎 儿的胃肠道 、 胰腺和肝脏 , 出生后组 织内的含量很 低 。 胃肠道恶性肿 瘤患者 的血清 中 CEA 的 水平升 高 , 在乳腺癌 、肺癌及其他恶性肿瘤患者的血清中也 有一定程度的升高 。 因此 , CEA 虽然不能作为诊断
[ Ab strac t] AIM :To estab lish a two-site tmi e-re so lved
fluo ro mi m unoassay (TRFIA) fo r de tection o f ca rc ino-emb ry-
[ 关键词 ] 癌胚抗原 ;时间分辨免疫荧光分析 [ 中图分类号 ] R 392. 33 [ 文献标识码 ] B
杭建峰 1 , 吴英松1 , 余伟鸿 2 , 黄 颖 3 , 李 明 1* (1南方医科大学生物技术学院 , 广东 广州 510515;2广州市达瑞抗体工
程技术有限公司 , 广东 广州 510663;3中国药品生物制品 检定所 , 北京 100050)
T mi e-resolved fluoromi m unoassay of mA b M 86160M 用 于 包 被 微 孔 板 , 另 1 株 抗 CEA 的 mA b
510663;3N ational Institute fo r the Con tro l of Pha rm aceutica l and Bio log ical P roduce s, Beijing 100050, China
的变异系数 (CV)分别为 7. 2% ～ 8. 6%和 8. 9% ～ 13. 2%。 与 A FP、 CA 12-5、 CA 19-9和白蛋白 均无交叉反 应 , 与 CA 15-3的 交叉反应值为 1. 62 μg /L。 将 1 000份血清标本用本法与国外 罗氏化学 发 光试 剂 盒 同 时检 测 , 其相 关 系 数 (r)为 0. 946。 结论 :CEA-TRF IA 的各项指标均达 到临床 检测 的要求 , 可 替 代国外同类检测试剂盒 , 用于临床血清 CEA 水平的测定 。
*Correspond ing au thor, Te l:(020)61648550 Em ail:m ingli@ fimm u. com
某种恶性肿瘤的特异性指标 , 但在恶性肿瘤的鉴别 诊断 、病情监测及疗效评价等方面 , 仍有重要的临床 价值 [ 2] 。时间分辨免疫荧光分析 (TRF IA )技术 [ 3, 4] , 为近年兴起的新型免疫学检测方法 , 根据待检物的 不同具有多种反应模式 (我们采用的 为双抗体夹心 法 )。 与国外相比较 , 该技术在国内起步较晚 , 市面 上的国产诊断 试剂更为少见 。 为此 , 我们应用 TRF IA 法对生产的 3批 CEA-TRF IA 诊断试剂进行了各 项指标的评估 , 并与罗氏 CEA 化学发光诊断试剂盒 检测的结果进行了比较 。
so lved fluo romi munossay (TRF IA)
[ 摘 要 ] 目的 :利用时 间分辨免 疫荧光 分析 (TRF IA )技术 , 建立一种人血清癌胚抗原 (CEA)的快 速全自动检 测方法并 研 制其诊断试剂 。 方法 :采 用双抗体 夹心法 (用 1株 抗 CEA 的
收稿日期 :2005 - 01 -20; 修回日期 :2005 - 06 - 20 基金项目 :广州市重大科技攻关项目资助 (N o. 2003U 130021) 作者简介 :杭建峰(1976 -), 男, 内蒙古呼和浩特人, 医师, 硕士.
9及 CA 15-3, 均购 自美 国 B iodesign 公司 。 96孔 微孔 板 (8 × 12)为 Labsy stem 公 司产品 。 Sephadex G-50系 Pha rm acia公 司 产品 。 Eu3 +标记试剂盒及专用 Eu3 +荧光增 强液 , 均购自 Pe rK in E lm e r公司 。 CEA 国家标 准品和质控血清 , 均为中国药 品 生物制品检 定所产 品 。 W a llac DELF IATM CEA 试剂 盒 和罗 氏 化学发光试剂盒 (R oche CEA k it)为美国 -芬兰 P erk in Elm e r公 司产品 。 血清标本 1 000份 (其中 CEA 阳性标本 556份 , 阴性 标本 444份 )及健康人标本 425份 , 来 自北京 301医 院 、 南 方 医院和广州军区总医 院 。其他 化学试剂 均为国产 分析纯 。 带 有滤膜的离心管为 M illipore公司 产品 。 A uto-D e lfia 1235全 自 动时间 分辨免疫荧 光检测仪 , 为美 国 -芬兰 Pe rkin E lm er公 司 产品 。 1. 2 方法 1. 2. 1 固相包被抗体的制备 用 50 mm o l /L、 pH 9. 6的碳 酸 盐缓冲液 , 将包被 mA b M 86160M 稀 释至 3 m g /L, 加 入到 96 孔微孔板中 , 每孔 200 μL, 于 4℃过夜 。 弃掉包被液 , 加 入封 闭液 (去金属离子的 20 g /L BSA), 每孔 250 μL, 封闭过夜 或 37℃ 2 h。 弃去封闭液 , 洗涤后真空抽干, 于 - 20℃冷冻保存 。 1. 2. 2 Eu3 +标 记 mA b 的 制 备 将 0. 5 mg 标 记 mA b M 86110M 加入到 带有滤 膜的 离心 管中 , 以 8 000 r /m in离 心 5 ～ 6 m in。 用标记缓冲液 (50 mm o l /L、 N a2CO 3, pH 9. 5)重 复 洗涤 6次后 , 将 200 μL标记 mAb和 0. 5 m g Eu3 +标记试剂 充 分混匀 , 于 4℃过 夜 。 1. 2. 3 Eu3 +标记 mAb M 86110M 的 纯化 将标 记 mAb 加 入 到 Sephadex G-50层析柱(1 cm ×30 cm)中 , 用洗脱液 (含 9 g /L N aC l的 50 mm o l /L T ris-HC l)洗脱 。 收集 流出 液 (1 m L 管/ ), 逐管测定蛋白含量 , 合并洗脱峰的 各管 , 同时以 Eu3 +标记 试 剂盒中的 Eu3 +标准 测定 洗脱峰 各管 中 Eu3 +的浓度 。 合并 后 计算 mA b的标记率和蛋白回收率 。 1. 2. 4 参考 标准 品的 制备 用含 2 g /L BSA 及 1 g /L N aN3 的 50 mm o l /L pH 7. 8 T ris-HC l缓冲液 , 将 CEA 抗原配制成 1、 5、 10、 100、 560 μg /L 系列浓度的标准 溶液 , 按每瓶 1 m L 分 装冻干 , 于 - 20℃干燥保存 。 1. 2. 5 分析操作程序 采用平衡饱和法中的两步法 , 即向 包 被板中加入 25 μL CEA 参 考标 准 品或 血 清样 品 , 同 时 加 入 200 μL 反应缓冲液 (含 5 g /L BSA、 9 g /L N aC l及 1 g /L N aN3 的 50 mm o l /L pH 7. 8 T ris-HC l缓冲液 ), 于室温震荡孵育 3 h。 用洗涤液 (含 9 g /L N aC l、 0. 2 g /L N aN3 及 0. 3 g /L Tw een80 的 50 mmo l /L pH 7. 8 T ris-HC l缓冲液 )洗板 4次 , 再加入 1∶75 稀释的 Eu3+标记 mAb 200 μL, 于室温孵育 1 h。 用洗涤液 洗 板 6次 , 最后加入 200 μL 增强液振摇 5 m in检测 。 全部过 程 均在 A u to-D e lfia 1235荧光检测仪上完成 。 1. 2. 6 CEA-TRF IA 法 几种 重要 检测 指标 的鉴 定 ( 1)准 确 度 :对试剂参考标准品与 相应浓 度的 国家标 准品 , 同 时进 行 分析测定 。 用双对数数学模型拟合 , 比较两条 剂量 -反应曲 线 的斜率并作 t检验 。同 时以 CEA 的国 家标准品 为对照 , 计 算
DO I 牶牨牥牣牨牫牬牪牫牤j牣cnki牣cjcmi牣牥牥牫牳牬牰
ISSN 1007 - 8738细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Ce llM o l Immuno l)2006, 22(1)
1 21
论著
文章编号 :1007 - 8738(2006)01 - 0121 - 04
癌胚抗原的时间分辨免疫荧光分析及其诊断试剂的研制
carc ino-em bryon ic an tigen and p repa- M 86110M 用于标记铕 )建立 CEA-TRF IA, 增强 液采用 β -二酮
ration of it’ s d iagnostic reagent
体为主的发光增强系统 。 结果 :CEA-TRF IA 的线 性测量 范围 为 (1 ～ 560) μg /L, 分析的灵敏度为 0. 28 μg /L, 批内和批间
1 材料和方法
1. 1 材 料 分 别用 于包 被和 Eu3 +标记 的两 株 抗 CEA mA b M 86160M 和 M 86110M 、 CEA 抗原 、 AFP 抗原 、 CA 12-5、 CA 19-
12 2
ISSN 1007 - 8738细 胞与分子免疫学杂志 (Ch in J Ce llM ol Immuno l)2006, 22(1)
on ic antigen (CEA) based on the d irect sandw ich techn ique
(O nLeabharlann Baidu m onoc lona l an tibody(mAb) is mi mob ilized on the sur- 随着临床检测技术的不断进步 , 定量检测方法
face o f m icro tite r p la te str ip we lls, ano the r mAb is labe lled w ith Eu3 +) and p repa re its d iag nostic reag en .t M ETHO DS: The sandw ich TRFIA fo r de tection o f se rum CEA leve l using an t-i CEA mAb s. RE SULT S:The measure range of CEATRFIA was ( 1 - 560) μg /L. The ana lytica l sens itivity was 0. 28 μg /L. The intra-and in te r-assay coe ffic ien ts o f var iation(CV) w ere 7. 2% - 8. 6% and 8. 9% - 13. 2%, respective ly. The re was no cross-reaction to AFP, CA12-5, CA199 and a lbum in . C ross reactivity to CA15-3 was 1. 62 μg /L. The co rre lation coe ffic ien t o f b lood sam p le s de tected by