植物组织游离脯氨酸含量的测定

植物组织游离脯氨酸含量的测定

原理

植物在逆境条件下，游离脯氨酸便会大量积累，且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。

采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。

材料、仪器设备及试剂

1．材料

植物叶片

2．仪器设备

分光光度计；水浴锅：漏斗：大试管(20m1)；具塞刻度试管(20m1)

注射器或滴管(5～lOml)。

3．试剂

(1)3％磺基水杨酸溶液

(2)甲苯；

(3)2.5％酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mo1.L-l磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3天有效；‘

(4)脯氨酸标准溶液：准确称取25mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100ug.mL-l。再取此液10ml，用蒸馏水稀释至lOOml，即成10μg．mL-1的脯氨酸标准液。

1．标准曲线制作

（1）取7支具塞刻度试管按表9.2-1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。

(2)取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管匀对照在波长520nm下比色。

（3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程

表9．2．1各试管中试剂加入量

试管0 1 2 3 4 5 6 脯氨酸标准溶液(m1) 0 0．2 0．4 0．8 1．2 1．6 2．0 水(m1) 2 1．8 1．6 1．2 0．8 0．4 0 冰乙酸(m1) 2 2 2 2 2 2 2茚三酮显色液(m1) 3 3 3 3 3 3 3样品测定

（1）脯氨酸提取：取不同处理的剪碎混匀植物叶片0．2～0．5g(干样根据水分含量酌减)，分别置于大试管中，加入5m1 3％磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min。

(2)取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2m1，加2m1冰乙酸和3m1显色液，于沸水浴中加热40min，下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色（向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管匀对照在波长520nm下比色）。

(3)结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度

脯氨酸含量的百分数。

脯氨酸[μg.g-1(干或鲜重)](C．V)·(a·W)－1

式中：C一提取液中脯氨酸浓度(PS)，由标准曲线求得：

V －提取液总体积（ml）

A --- 测定时所吸取得体积（ml）

W----- 样品重（g）