免疫组织化学检验技术.ppt

第一节 免疫组化检验技术基本知识
免疫组化全过程
一、标本制作
• 标本制作是获得良好的免疫细胞组织化学分析的保障，良好的细胞 和组织学结构将有助于抗原的准确显示和定位。
（一）标本的主要来源 主要有： ①活体组织 ②各种体液及穿刺液 ③培养细胞等
（二）标本的固定与保存
1．组织材料的固定目的
①防止组织细胞的死后变化，以保持其固有形态 ②使细胞内的蛋白质等各种抗原成份转变成不溶性 物质，以保持它原有的结构 ③使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同 的折射率，以便染色后易于鉴别和观察 ④固定剂兼有硬化作用，使组织硬化，便于制片 ⑤防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构 ⑥经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着 色清晰，便于辨认。
（四）切片方法的选择
二、抗原处理
（一）进行抗原的暴露和修复的原因
1.固定液的影响 2.抗体制备的影响
（二）抗原的暴露
主要采用酶消化的方法 在选择酶消化时，应针对要显示的不同的抗原成分而选用不同的 酶 在日常工作中用胰蛋白酶消化即可
（三）热诱导的抗原修复
抗原修复是以高温、高压对常规固定石蜡切片进行抗原修复以提 高抗原抗体的阳性检出率 • 微波处理法 • 水浴锅法 • 压力锅法
酶标记抗体免疫组织化学染色法 非标记抗体酶免疫组织化学染色法
二、酶标记抗体的免疫组化染色法
（一）原理 酶标记抗体的免疫组织化学染色法是借助交联剂的共价键作用
将酶直接连接在抗体（或抗抗体）上，酶标抗体（或抗抗体）与 组织内特异抗原或抗原抗体复合物反应后，通过酶对底物的催化 作用，生成不溶性有色产物并沉淀在特定位置，达到对抗原定性、 定位、定量检测的目的。
（三）阴性结果
阴性结果不能简单视为抗原不表达，由于染色方法灵敏度有高低之 分，有时可因灵敏度不够，而导致阴性反应。
（四）特异性显色和非特异性显色的鉴别
1.分布位置 特异性反应必须分布于特定抗原部位 非特异性反应无一定的分布规律
2.显色强度
特异性反应由于细胞内抗原含量不同，显色强度不一。阳性细胞的 染色常定位于细胞，并与阴性细胞间有明显间隔
4.自身对照
是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。
（二）阳性结果
• 阳性细胞的显色可位于细胞膜、细胞质和细胞核 • 免疫显色强度和阳性细胞密度是定性、定量指标 • 阳性细胞的着色形态（如胞膜型、胞核型、胞质(浆)型等）及组织分
布特点（如局灶型、弥漫型、片块型等）主要是定位指标 • 哪怕只有少数细胞阳性（只要是抗原所在部位）也应视为阳性表达
（二）技术类型
1.酶桥法
用辣根过氧化物酶（HRP）免疫动物（如兔）制备抗HRP的抗体 （Ab3），经Ab2（如羊抗兔）作桥，将结合在组织抗原上的Ab1(兔 抗相应组织抗原的抗体)与Ab3连接起来，最后将HRP与Ab3结合形成 Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP复合物，加底物显色
2．固定剂的选择 最佳固定剂的标准 ①最好地保持细胞和组织的形态结构 ②最大限度地保存抗原的免疫活性 3．固定方法 固定方法常用 ①浸泡法—主要适用于活检和手术标本以及其它不能进行灌注的组织 固定。 ②灌注法—适用于动物实验研究。
（三）玻片的处理
玻片的处理是做好免疫组化染色的重要步骤之一
一般用免疫组织化学的载玻片均需涂一定的黏合剂，常用的切片黏 合剂有树脂胶、多聚赖氨酸和防脱片剂
目的是证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除 假阴性的可能。 2.阴性对照
用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果， 称阴性对照。
目的是排除假阳性。
3.阴性试剂对照
是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂（尤其是特异性抗体试剂 的有效性和可靠性）而设立的同步免疫染色对照，包括有：空白对照、 替代对照、吸收试验和抑制试验等。
第二节 酶免组织化学检验技术
• 酶免组织化学检验技术是在一定条件下，应用酶标抗体（抗原） 与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，然后加入酶的底物， 催化底物显色，借助光镜或电镜，就可识别出标本中抗原（抗体）的 分布和性质；也可通过图像分析技术达到定量的目的。
一、标本制作
• 常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片 • 酶免组织化学检验技术可分为
而非特异性染色常不限于单个细胞，常为成片的细胞 3.其他
在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性显色
六、质量控制
• 质量控制是免疫组织化学检验技术取得满意结果的必要条件。 （一）试剂质量控制
抗体的质量是免疫组织化学染色成功的关键 （二）操作过程质量控制
实验操作 标本的质量控制 （三）仪器设备和器具的质量控制
三、抗体处理
• 抗体是免疫组织化学技术的首要试剂 （一）抗体的选择
具有高度特异性和稳定性的优质抗体 （二）抗体的稀释
抗原抗体反应须有适当的比例，过量或不足均不能达到预期结果 （三）抗体的合理保存
要特别注意保持抗体的生物活性
四、常用标记物
（一）荧光素 如：异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明等
（二）酶 如：辣根过氧化物酶(HRP)
（三）生物素-亲和素系统 （四）免疫金标记技术 （五）免疫铁蛋白技术
五、免疫组织化学技术的结果判断
（一）对照染色设计 为了保证免疫组织化学染色的准确性，证明和肯定
阳性结果的特异性，排除某些非特异性染色，通常需 针对第一抗体设立对照。 1.阳性对照
用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫组 织化学染色。
免疫学检验
第二十二章 免疫组织化学检验技术
• 免疫组织化学检验技术又称免疫细胞化学检验技术
---是利用标记的特异性抗体（或抗原）与组织细胞内抗原（或抗体） 进行的抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对组织和细胞抗原进行 定性、定位
免疫组化的检测原理
（二）技术类型 1.直接法
形成抗原一抗体一酶复合物 2.间接法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E复合物 3.酶标抗体三步染色法 为间接法的改良法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E复合物
（三）方法评价
三、非标记抗体酶免疫组化染色法
（一）原理 该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体
（Ab3），将酶与Ab3结合形成复合物，然后利用第二抗体（Ab2） 作桥，Ab2既可与 Ab3的Fc段结合，又可与结合在组织抗原上的第一 抗体（Ab1）的Fc段结合，经酶催化底物的显色反应，达到对抗原的 检测。