基因克隆主要载体系统
基因克隆技术的基本步骤
基因克隆技术的基本步骤随着科技的不断发展，基因克隆技术越来越成为生命科学研究的重要手段。
在生命科学、医学等领域，基因克隆技术的应用十分广泛。
本文将介绍基因克隆技术的基本步骤。
一、选择载体DNA在基因克隆中，载体DNA是将外源DNA（待克隆DNA）转化进细胞的基础。
目前主要的载体DNA是质粒，其一般大小在1至20 kb之间。
质粒的选择应遵循以下几个原则：1. 合适的选体标识。
大多数载体都有一些明显的特征，例如特定的抗生素抗性或颜色，因此选择能够用于筛选的选体标识是基本原则之一。
2. 合适的克隆位点。
载体DNA上应具有克隆位点，以便将待克隆DNA插入到其中。
3. 可重复复制。
质粒必须带有在细胞内自我复制所必需的序列。
二、切割DNA通过限制性内切酶切割将待克隆DNA和载体DNA裂解成短的DNA片段。
这些片段在电泳时可以按照大小区分开，以便以后的克隆工作。
三、将外源DNA插入载体DNA外源DNA和载体DNA的连接需要使用DNA连接酶，如DNA ligase。
方法是将两个DNA片段的末端和连接起来形成一个完整的DNA分子。
连接成功后，形成了一个混合DNA。
由于载体的复制和传递，待克隆DNA也可以被大量复制。
四、将混合DNA转化进宿主细胞将混合DNA转化进宿主细胞是整个克隆过程中至关重要的一步，因为宿主细胞受到质粒的干扰，催化质粒遗传信息的传递与表达。
大多数质粒都需要在易感受性细胞中才能存在并复制。
宿主细胞的选择是非常重要的，有些宿主细胞对外源DNA的吸收和扩增效率非常高，充分利用每一个获得的外源DNA分子。
五、筛选克隆基因最后一步是克隆基因的筛选，筛选克隆基因需要具有合适的筛选方法。
常用的筛选方法是使用抗生素抗性，因为载体上通常带有抗生素基因，能够筛选那些携带载体克隆块的细胞。
克隆基因的筛选方法不止于抗生素抗性，还可以根据不同的克隆目标进行选择。
例如，当克隆目标是蛋白质时，可以使用融合蛋白法克隆兴趣的编码DNA，并利用其蛋白质结构的特点分离出融合蛋白。
第三章 基因克隆载体
（2）中间质粒克隆载体 T-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。 共整合克隆载体系统（T-DNA同源序列、bom 位点） 双元克隆载体系统——微型Ti质粒
（四）乳酸杆菌质粒克隆载体（略）
乳酸杆菌：G+，非致病，益菌生，用于食品和饮料。 质粒宿主范围广泛：可用于其它G+菌及大肠杆菌。 构建： 乳酸杆菌本身对km、Ap抗性较强。 标记基因： 选用lacZ，如有pLJ1复制启始位点的
一、质粒适于载体构建的性质
１、组成与构型 质粒(plasmid)是染色体外裸 露的双链DNA分子（细菌、真 菌、蓝藻、绿藻）
l-DNA 构型： oc-DNA
２、分子大小： 100～102 kb
３、复制 特点：在宿主细胞内进行单向复制。 质粒和宿主细胞双重遗传系统控制复制强度： 拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值） （１）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳 定。
BR：两位主要构建者 322：实验编号
ColE1 松驰型 ，筛选系统复杂。衍生的pMB1 为出发质粒（松弛型复制起始位点，但缺较好 的选择标记基因和克隆位点）。
pSC101（最早用于DNA克隆的载体），严紧 型，含有Tcr 基因。
构建过程(出发质粒：pMB1)
R1（沙门氏菌中分离） 变异 R1drd19
这是Ti质粒用于遗传转化的理论依据。
用野生型Ti质粒获得的转基因植物细胞 只能分裂，不能分化为植株，故不能直接选 育转基因植物。
（2）Vir区
位于T-DNA区上游，其表达产物可激活TDNA的转移，显示致瘤性。
（3）Con区
含有农杆菌之间接合转移有关的基因（tra)， 可受宿主产生的冠瘿碱活化，使Ti质粒在细菌 间转移，也即接合转移基因编码区。
第三章 基因克隆的载体
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
外源基因Pst I Tet中存活 但在Amp中死亡
② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③ 高拷贝数
2. 质粒载体相关知识介绍
（4）pBluescript SK
pBluescript SK is similar to the pGEM vectors except that it also carries an origin of replication for a filamentous phage, f1. f1 uses a single stranded DNA molecule as a genome and pBluescript KS
表达型质粒载体
装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯 化的元件，主要用来使外源基因表达出 蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。 如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆 的真核生物的基因臵于大肠杆菌的转 录—翻译信号控制之下。
① 表达载体的结构
1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS
1.质粒的生物学特性
（4）质粒的复制类型 一种质粒在宿主细胞中存
在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为 两种复制型：“严紧型”质粒（stigent plasmid）, 拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid）, 拷贝数为10-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在 不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。
基因克隆的载体 巨详细
3、加入200微升微冷的®液（0.2NaOH， 1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。
65度水浴一段时间会加强染色体DNA的变性作 用。
4、加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸钠，振荡 后，冰浴5分钟。
质粒载体
1. 克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要 是DNA水平上的操作。
2. 基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表 达。
一、质粒的生物学特性：
1、质粒DNA的构型：
SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L 型 线性DNA（cDNA）
复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。
Example：
pBEU1和pBEU2质粒，在30度下，每个寄 主细胞只含有适量的拷贝数，当培养温度超过 35度时，质粒的复制将失去控制，每个细胞中 的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细 胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续 2‾3小时。最后得到超量的基因编码产物，细 胞生长受抑制失去存活能力，积累的质粒DNA 占细胞总DNA的50%。
在PH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA 会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变 性。
通过冷却或恢复中性PH值使之复性，线性 染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅 速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有 cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质 粒DNA
3.碱变性法：
1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在 微量离心管中，离心收集细胞沉淀；
DNA，一般大小约106‾108D，可自身复制和表 达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药 性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良 好的载体。
(整理)基因克隆的质粒载体
基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col 质粒。
①F质粒又叫F因子或性质粒( sex plasmid )。
它们能够使寄主染色体上的基因和F 质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。
②R质粒通称抗药性因子。
它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
③Col 质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。
它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。
大肠杆菌是一类可以使不带有Col 质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。
第一节质粒的一般生物学特性、质粒DNA细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。
绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子 (图4-1) 。
质粒 DNA 分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状， 但在一定的条件下又 可逆地整合到寄主染色体上， 随着染色体的复制而复制， 并通过细胞分裂传递到 后代。
环形双链的质粒 DNA 分子具有三种不同的构型 ： 1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形 DNA （cccDNA ），这样的 DNA 通常呈现超螺旋的 SC 构型 ；2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现 有一至数个缺口时，称之为开环 DNA （ocDNA ），此即 OC 构型 ；3．若质粒 DNA 经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线 性分子（ IDNA ），通称 L 构型（见图 4-2 ）。
在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒 DNA ，尽管分子量相同，仍具 有不同的电泳迁移就绪。
其中走在最前沿的是 SC DNA ，其后依次是 L DNA 和OCDNA（图4-3 ）。
凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator ）、选择性记和克隆位点。
简述基因克隆载体的主要类型
简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。
常用于基因工程中，将特定基因序列克隆到载体DNA上，进而进行转化和表达。
根据不同的功能和应用，基因克隆载体可以分为多种类型，以下是主要的几种：
1. 质粒（Plasmid）：质粒是最常用的基因克隆载体之一，通常起源于细菌，具有自主复制的能力，易于操作和扩增。
质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。
2. 病毒载体（Viral Vector）：病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体，具有高度的转染效率和生物安全性。
病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）：人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体，通常具有高度的稳定性和扩增性能。
人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。
4. 原核表达载体（Prokaryotic Expression Vector）：原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。
原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点，被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
基因克隆载体
克隆载体的DNA分子必须具备的条 件
作为载体应该具备以下基本条件： 1.具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）
2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位 点，较高的遗传稳定性; 3.具有较小的分子量，易于操作，具有较高的外源 DNA的载装能力 4.在非必需区具有多种单一的限制酶酶切位点； 5.外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自 我复制;
低拷贝的质粒，每个寄主细胞中仅含有1-3份拷 贝
松弛型复制控制的质粒 stringent plasmid
高拷贝的质粒，每个寄主细胞中含有10-60 份拷贝
质粒复制控制的分子模型
目前公认的用于阐释质粒DNA复制控制 机理的分子模型有两种：
其一是抑制蛋白质稀释模型(inhibitor dilutionmodel)。
(2)自体阻遏蛋白质模型
在抑制蛋白质稀释模型提出若干年之后， L.Sompayrac和O.Maaloe也提出了另外 一种解释质粒DNA复制机理的自体阻遏蛋 白质模型,这个模型对质粒DNA复制控制机 理的一种解释是，质粒DNA的复制是由一 种叫做起始蛋白质Rep引发的。这种蛋白 质是质粒DNA复制启动作用的限速因子， 它的浓度决定着每个细胞每个世代之质粒 分子的最终复制总数。
Relaxed circle Linearized form Super-coiled form
质粒的类型：按分子特性分成接合型和非接合 型，接合型的质粒，又叫自我转移的质粒，带 有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一 套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
按表型特性分成F质粒、R质粒、Col质粒。
从理论上讲，任何DNA分子均可以物理渗 透的方式进入生物细胞中，但这种频率极低， 以至于在常规的实验中难以检测到。某些种类 的载体DNA分子本身具有高效转入受体细胞 的特殊生物学效应，因此由外源基因与载体拼 接所形成的DNA重组分子传入受体细胞的机 率比外源DNA片段单独转化提高几个数量级.
基因工程(基因工程的基本条件-载体系统)
(二)质粒载体(Plasmid)
1. 质粒的一般生物学特征
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而 自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；
质粒常见于原核细菌和真菌中； 绝大多数的质粒是DNA型的； 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分
子结构，即cccDNA； 质粒DNA的分子量范围：1-300 kb。
D-DNA ocDNA cccDNA
但变性的线性染色体DNA分子复性时不准确，也不迅 速，因此彼此聚集形成网状结构,通过离心分离便与变 性的蛋白质及RNA一起沉淀下来，而仍滞留在上清液中 的质粒DNA则可用酒精等沉淀收集。
沸水浴法 用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体； 加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 沸水浴40秒钟； 离心，用无菌牙签挑去沉淀物； 乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA；
λ噬菌体生物学特性：溶原状态
➢λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也 可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上， 并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态； ➢整合主要由λ-DNA上的cI和int两基因的产物所激 活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞 本身的性质； ➢人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质， 使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态；
4363 bp
ROI
➢用于基因克隆
ROP Origin of Replication Hind II
Sal I Bal I
pUC18/19：
EcoRI SstI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII
➢分子量2686bp； GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT
常用克隆载体
PAC ( P1-derived artificial chromosome, 插入片 段可达300kb)
本图所表数字是 以 EcoR I 位点中央计为0， 从顺时针方向计算，至各 酶切位点的 第一个碱基的 数。在圆的内 部所表示的 各限制酶是在 pBR322 DNA上只有一个酶 切位 点的酶，圆外所表示的各 酶是在pBR322 DNA上 有2个至3个的酶切位点的 酶，（）内的数是酶切位 点数
质粒载体pUC19
缺点：插入M13的外源DNA超过1000bp时就不稳定，在 噬菌体增殖时会出现缺失。
噬菌粒载体
由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列， 称为噬菌粒（phagemid）。
噬菌粒（phagemid）是带有丝状噬菌体复制起始点的 质粒。
pUC118/pUC119噬菌粒载体; pBluescript噬菌粒载体（最常用，M13载体在多克隆 位点的两侧引入了T7和T3两个噬菌体的启动子。）
常用的粘粒载体
用于在细菌中增殖真核DNA的粘粒载体 pJB8, c2RB, pcos1EMBL 用于转染哺乳动物细胞的粘粒载体 cos202/203，pWE15/16
粘粒的主要特征
（1）由质粒与组成的一种4-6kb的环状杂种DNA， 容易分离并可分离操作。既能像质粒一样在细菌 中繁殖，又能像一样在体外包装，并高效导入受 体细胞。
基因工程常用的克隆载体
克隆载体
目的基因进入细胞必须要有载体（vector） 的运载作用才能实现。
载体运载外源DNA至宿主细胞，是通过 载体自身DNA的核酸序列中插入了外源 DNA，再进入宿主细胞内进行的DNA复制， 在载体DNA复制时，外源DNA分子也获得 了复制（扩增）和表达。
四、基因克隆载体(一)
2、pBR322
p—plasmid，BR分别为该质粒的两位主要构 建者F. Bolivar和R.L. Rodriguez姓氏的头一个字 母，“322”为实验编号。
含有双抗基因（Apr，Tcr）和Col E1复制起始 子。
融合型蛋白表达载体：pET28a
非融合型蛋白表达载体：pKK223-3（强启动子Ptac）
（三）、质粒载体的构建
构建质粒克隆载体的基本策略如下：
① 构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行 有效的复制并且作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中 有较多的拷贝数。 * 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
克隆载体(cloning vector)： 指能够把外源DNA片段带入受体细胞，并进
行稳定遗传的DNA或RNA分子
穿梭载体(shuttle vector)： 带有两种不同的复制起始位点，可以在两种
不同的生物体中复制的质粒载体
表达载体(expression vector) 一种克隆载体，可以使插入的外源DNA片段
严紧型质粒(stringent plasmid)：拷贝数少，1－数个， 松弛型质粒(relaxed plasmid) ：拷贝数多，10个以上
（提取质粒时，可添加氯霉素）
4. 质粒的不亲和性(Incompatible):
两种类似的不同质粒不能存在于同一细胞中。 亲和质粒、不亲和质粒
5. 质粒的可转移性：
D） Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物， 促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移
E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr， F） 产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒） G） 降解基因：降解重金属、有机物和农药等 H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒
第四章 基因克隆的质粒载体
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（ SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2021/8/4
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碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
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8.质粒ＤＮＡ的分离与纯化
(1)氯化铯密度梯度离心法 (2)碱变性法 (3)微量碱变性法
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氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子
量的细菌染色体易断裂成线性片段，而质 粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的 状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链 的碱基中，导致链的解旋；而且形成的 EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会 越低。
线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而 形成。称L构型。
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什么是超螺旋(superhelix 或supercoil) ？ DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺
旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态， DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构 的一个重要特征。
迁移作用(mobiligation): 由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.
2021/8/4
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从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。 因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障 的潜在危险.
克隆载体的基本结构
克隆载体是指在基因工程中用来携带和复制目标基因的一类DNA分子。
它具有以下基本结构：
1.起始子：克隆载体中通常包含一个起始子，用于启动基因表达。
起始子通常是一段特定的DNA序列，可以与细胞的转录因子相互作用，从而使目标基因开始转录。
2.复制起点与选择标记：克隆载体中含有复制起点，该起点可以被细胞内的DNA 复制酶识别并复制。
此外，常会在载体中引入选择标记，如抗生素抗性基因，用来筛选带有载体的细胞。
3.多克隆位点：多克隆位点是载体中用来接受目标基因的特定位置。
常见的多克隆位点包括限制性内切酶切割位点、连接酶切割位点等。
通过在多克隆位点插入目标基因，可以实现基因的克隆和表达。
4.报告基因：有时候，克隆载体中还会引入报告基因，用于检测目标基因的表达情况。
报告基因通常是一种易于观察或测量的基因，如荧光蛋白基因，它可以发出特定颜色的荧光。
总的来说，克隆载体的基本结构是由起始子、复制起点与选择标记、多克隆位点和报告基因等组成。
通过这些结构的设计和组装，可以方便地进行目标基因的插入、复制和表达。
第九章 基因克隆载体
接合型质粒（传递性质粒） 非接合型质粒
严密型质粒（stringent plasmid)
严密型质粒通常是一些具有自身传递能力的大质粒，复制与 宿主菌密切相关，宿主菌内只有1-2个质粒拷贝存在，当宿主 菌蛋白合成停止时，质粒的DNA复制也就随之停止
松弛型质粒 (relaxed plasmid)
第九章 基因克隆载体
第一节
概述
1、载体
要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中， 需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫
载体（Vector）。
（1）质粒 （2）噬菌体 （3）质粒-噬菌体杂合载体 （4）人工染色体载体
2、载体的性质
1）它必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达的能 力。
pJDB 219
选用哪种类型的真菌质粒？
转化频率 YEps：103—105 YIps：1-10 转化子的稳定性 YEps：不稳定 YIps：稳定
第三节 噬菌体载体
噬菌体的研究历史，是同 分子生物学、分子遗传学的创 立和发展过程密切相关的。DNA 复制机理的阐明、转录的终止 作用、连接酶和解旋酶的发现 、位点特异的重组作用、SOS修 复机制等，均是以噬菌体为材 料取得的重要研究成果。依据 噬菌体的复制和生活周期等特 点，已经构建了许多料。
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三、质粒在基因工程中的应用优点 ①体积小，便于DNA的分离和操作； ②呈环状，使其化学分离过程中能保持性能稳定； ③有不受核基因组控制的独立复制起始点； ④拷贝数多，使外源DNA 可很快扩增； ⑤存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒克
隆的检出和选择（如E.coli 的pBR322质粒）。
四、质粒的分离与鉴定 分离：细胞的裂解、蛋白质和RNA去除以及质粒 DNA与染色体DNA分离。 鉴定：电镜、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳及密 度梯度离心法。
基因克隆的载体噬菌粒载体
基因克隆的载体噬菌粒载体
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4. 存在着一个多克隆位点区，所以许各种不一样类型外 源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；
5. 因为多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因5’端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验， 筛选重组子；
基因克隆的载体噬菌粒载体
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常见噬菌粒载体pUC118和pUC119
是一对分别由pUC18和pUC19质粒与野生型M13噬菌体基 因间隔区（IG）重组而成噬菌粒载体。
1. 含有较小分子量共价、闭合、环形基因组DNA，可克 隆10kb外源DNA片段，并易于进行分离与操作；
2. 编码一个ampr基因作为选择记号，所以只有携带 pUC118或pUC119噬菌粒载体大肠杆菌转化子细胞，才 能够在含有氨苄青霉素培养基中生长，便于转化子选择；
6. lacZ基因是置于lac开启子控制之下，这么插入 外源基因便会以融合蛋白质形式表示；
7. 含有质粒复制起点，在没有辅助噬菌体情况下， 克隆外源基因能够像质粒一样按常规方式，复 制形成大量双链DNA分子
基因克隆的载体噬菌粒载体
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8. 带有一个M13噬菌体复制起点，在有辅 助噬菌体感染寄主细胞中，能够合成出 单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌 到培养基中；
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pBluescript噬菌粒载体
基T3和T7噬菌体开 启子，能够定向指导外源基因转录活动；
2. 同时含有一个单链噬菌体M13或f1复制起点 和一个来自ColE1质粒复制起点，在不一样情 况下，能够采取不一样复制形式，分别合成单 链或双链DNA；
3. 编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化 子记号；
简述基因克隆主要过程
简述基因克隆主要过程基因克隆是指将一个特定的基因从一个细胞或生物体中复制并插入到另一个细胞或生物体中的过程。
这项技术的发展为生物学和医学研究提供了重要的工具，也给基因治疗和转基因技术等领域带来了巨大的希望。
下面将以简述的形式介绍基因克隆的主要过程。
基因克隆的主要过程可以分为以下几个步骤：1. 提取DNA：首先，需要从源细胞或组织中提取目标基因的DNA。
这可以通过破碎细胞壁和细胞膜来释放DNA分子。
常用的提取方法包括化学法、机械法和酶法等。
2. 制备载体：接下来，需要准备一个载体来携带目标基因。
载体可以是环状的质粒DNA或病毒基因组。
质粒是一种小型DNA分子，它可以在细胞内自主复制，并且可以被插入到其他细胞中。
病毒基因组则是利用病毒的自身复制机制来传递基因。
3. 限制性内切酶切割：为了将目标基因插入到载体中，需要使用限制性内切酶来切割DNA。
限制性内切酶是一种能够识别特定DNA 序列并切割它们的酶。
通过选择适当的限制性内切酶，可以将目标基因和载体的DNA分子切割为互补的粘性末端。
4. 连接目标基因和载体：将目标基因和载体的DNA分子连接起来，可以使用DNA连接酶。
这种酶可以将目标基因和载体的DNA分子的末端粘性连接在一起，形成一个完整的复合DNA分子。
5. 转化或转染：将连接好的复合DNA分子引入到目标细胞中。
转化可以通过热激冲击、电穿孔或化学方法等多种方式实现。
转染则是将复合DNA分子包装成特定的脂质体或使用病毒作为载体，将其引入到细胞内。
6. 筛选和鉴定：在转化或转染后，需要对细胞进行筛选和鉴定，以确认是否成功插入了目标基因。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选和PCR扩增等。
通过筛选和鉴定，可以确定哪些细胞成功地表达了目标基因。
7. 扩增和表达：成功鉴定出含有目标基因的细胞后，可以将这些细胞进行扩增和培养。
这样可以获得大量表达目标基因的细胞，并进一步研究其功能和应用。
总结起来，基因克隆的主要过程包括提取DNA、制备载体、限制性内切酶切割、连接目标基因和载体、转化或转染、筛选和鉴定，以及最终的扩增和表达。
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SV40病毒
SV40病毒，环状DNA，外壳蛋白由VP1、VP2、VP3 构成。 受纳细胞（permissive cell， 也称允许细胞 ）： 能使细胞裂解释放感染性病毒颗粒。 非受纳细胞（non permissive cell）：不产生 感染性病毒颗粒，但能整合到细胞染色体中产生 癌变。 基因结构:
3 、载体的共同特征（或应具备的条 件）：
①自主复制
②易于扩增分离纯化
③有单一酶切位点（多克隆位点） 单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切 位点 多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单 一酶切位点 ④有选择标记基因 ⑤表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、 终止子,SD序列） ⑥具有较好的安全性，避免基因的非控制扩散
5.其他载体
（1）酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YAC） （2）细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC） （3）动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒、 腺病毒相关病毒、逆转录病毒）
三 真核细胞的克隆载体
二、植物表达载体
多数植物表达载体是质粒载体
最经典的植物表达载体是pBI121
植物表达载体与克隆质粒载体一样, 可以 克隆基因, 但还具备表达所克隆的基因的 特性
(15kb)
三、动物细胞基因克隆的载体
㈠SV40病毒 ㈡SV40病毒载体
(1)取代型重组病毒载体 ①晚期区段取代载体 ②早期区段取代载体 (2)重组的病毒-质粒载体
附加体型载体（YEP）
YEP型载体一般由大肠杆菌质粒、2µm质粒以及酵母染色 体的选择标记构成。 2µm质粒含有自主复制起始区（Ori）和STB区,STB序列 能够使质粒在供体细胞中维持稳定。利用2µm质粒，人们 已经构建出许多YEP型载体。 YEP型载体PYF92就是由酵母的2µm质粒、pBR322质粒 和酵母的His3+(组氨酸)基因构成的。 YEP型载体对酵母具有很高的转化活性，一般为103-105 转化子/微克DNA。比YRP型载体更稳定，拷贝数也高 （25-100个/细胞），是基因克隆中的常用载体。
(三)质粒载体的选择记号
新陈代谢特性； 对大肠杆菌素E1的免疫性； 抗菌素抗性； 四环素抗性、氨苄青霉素抗性、 链霉素抗性、卡那霉素抗性 大多数质粒本身带有抗菌素基因； 抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。
(四) 常用的质粒载体
pSC101质粒载体； ColE 质粒载体； pBR322质粒载体； pUC质粒载体；
2.粘性质粒（Cosmid）带有λ 噬菌体的Cos位点和 整个pBR322的DNA顺序。经感染进入细菌细胞以 后在细胞中进行复制。易环化和扩增。分子量小， 可包装30-45kb外源基因的性质：自我自制；可转化；包含克 隆位点； (2)含有Cos位点：带有λ 噬菌体的黏性末端片段； (3)能承载较大的外源DNA片段：可承载大于自身大 小的DNA片段
复制型载体（YRP）
YRP型载体是带有选择标记和复制子的酵母的 DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。因为 它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因， 所以能在两种细胞中存在和复制 可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体 称为穿梭载体（如图3-20），穿梭载体在基因 工程中广泛使用。 YRP型载体转化率高，拷贝也高，但不稳定， 易丢失。
环状 环状 线性染色体
100 - 2000 kb
100 - 2000 kb
〉 1000 kb SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
线性染色体 环状 环状
质粒载体
噬菌体载体
真核细胞的克隆载体
一 、质粒（plasmid）载体
质粒是一种独立于染色体外的小分子环状
一、在酵母细胞中克隆基因常用的载体 1.整合型载体（YIP） 2.复制型载体（YRP） 3.附加体型载体（YEP） 二、植物基因克隆的载体——Ti质粒 三、动物细胞基因克隆的载体
一、在酵母细胞中克隆基因常用的载 体 整合型载体（YIP）
YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构 成的。如Pyeleu10是由ColEI质粒和酵母DNA提供 的亮氨酸基因（Leu2+）片段构成，在细菌中复 制、扩增，进入酵母后可整合表达。YIP型载体 的特点是转化率低(只有1-10转化子/微克DNA)， 但转化子遗传性稳定稳定，多用于遗传分析工作。
噬菌体的分类
根据噬菌体与宿主的关系，将噬菌体分为温和性 噬菌体和烈性噬菌体
温和性噬菌体：噬菌体感染宿主细胞后，其DNA与宿主染 色体DNA融合，一起复制和传代，无感染其他细胞的能力 烈性噬菌体：噬菌体感染宿主细胞后，其DNA不插入宿主 染色体DNA，经过一定的潜伏期，就大量的增殖新颗粒， 使宿主细胞裂解，释放出的噬菌体颗粒又感染其他细胞
DNA，一般大小约106-108D，可自身复制和表 达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药 性基因，常有1 - 3个抗药性基因，以利于筛选。 所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。 作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
质粒的类型
传递类型： ①接合型：含有自主转移基因，使质粒从一个细胞转 移到另一个细胞。如： F质粒、部分R、Col质粒 ②非接合型：不含自主转移基因，质粒不能自主从一 个细胞转移到另一个细胞。如部分R、Col质粒 复制类型： ①严紧型(stringent plamid):低拷贝，1-3个拷贝/菌 ②松弛型(relaxed plasmid):高拷贝，10-60个拷贝/菌
(一) 质粒载体
质粒载体包括以下两种： 1.克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是 DNA水平上的操作。 2.基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。
(二) 质粒载体必须具备的基本条件
(1) 具有复制起点； 自我增值的基本条件，一般具一个复制子。 (2) 具有抗菌素抗性； 理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。 (3) 具有若干限制酶切单一位点（CMS）； (4) 具有较小的分子量和较高的拷贝数。 低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断后 仍能有效的转化给受体细胞,同时低分子量的质粒 对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高 的拷贝数可获得大量的克隆基因
重要的噬菌体载体
分子生物学中常用的噬菌体载体有： 1.λ 噬菌体载体 （1）类型:插入型载体和替换型载体 （2）应用： ①转染作用 转染：由宿主细胞捕获噬菌体或病毒DNA的过程。 转导：以噬菌体为媒介转移遗传物质的过程。 转化：质粒等外源DNA引入细胞的过程。 ②λ DNA的体外包装
重要的噬菌体载体
(2)重组的病毒-质粒载体
由大T抗原、复制子和pBR322构成 pAC10载体。在细菌中扩增提取基因重 组质粒，转染小鼠细胞5-6天后可高拷 贝扩增、进而高表达基因产物（如图 3-30）。另外微型病毒复制子-质粒载 体，可用特殊细胞来克隆和表达
4.噬菌粒载体
由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型 的载体系列 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆 位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定 存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助 噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生 单链的子代噬菌体。
常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119
重要的噬菌体载体
3.单链DNA噬菌体载体-M13噬菌体克隆 载体
（1）பைடு நூலகம்13噬菌体的生物学特性：
M13是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状 大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类 载体主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段，这种 单链ＤＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定Ｄ ＮＡ序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变 研究、异源双链DNA的分析等。
酵母细胞
哺乳类细胞 动物细胞 动物细胞 和细菌
环状
线状 环状 环状
〈 8*
9 - 24kb 〈 10 kb 35- 45kb ≈300 kb
λ 噬菌体 丝状噬菌体及噬菌粒 粘粒载体 BAC (Bacterial Artificial Chromosome) PAC (P1-derived Artificial chromosome) YAC (Yeast Artificial chromosome ) MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 病毒载体 穿梭载体
T载体
其它的重要的质粒载体
二
噬菌体载体
（Bacteriophage，简称phage）
噬菌体的一般生物特性
可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。 除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：
1、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭
环境化学物质的破坏； 2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞； 3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体 系，从而长生出大量的子代噬菌体颗粒； 4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒
基因克隆主要载体系统
学 生：张建苓 指导老师：胡廷章
1、载体定义 载体(vector)：基因工程重组DNA技 术中，将DNA片段（目的基因）转 移至受体细胞的一种能自我复制的 DNA分子。
2、类型 （1）根据功能可分为： 克隆载体 表达载体 整合载体 （2）根据来源可分为： 质粒载体 噬菌体载体 真核细胞克隆载体
载体的种类和特征
受体细胞 质粒* 结构 插入片断 举例 pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列 M13mp系列 pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV Pel oBAC系列 PCYPAC1
E.coli
E.coli E.coli E.coli E.coli E.coli