生物化学实验报告-3,5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线

实验二3,5-二硝基水杨酸比色定糖法定制葡萄糖标准曲线

马铃薯总糖含量测定

（有成都大学提供）

实验目的

1. 熟悉并掌握7200型分光光度仪的结构及工作原理和操作使用方法；

2. 掌握分光光度法测定物质含量的基本操作步骤及微机绘制标准曲线的操作方法；

3．掌握3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖（葡萄糖）的原理及方法；

4．掌握3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定马铃薯总糖含量测定的原理与方法。

实验原理

1. 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖（葡萄糖）的及标准曲线定制原理

3,5-二硝基水杨酸在强碱溶液中与还原糖在沸水浴中加热反应后被还原成棕红色的氨基化合物，该有色物质在540nm 处有最大吸光度，且在一定浓度范围内（一般OD值在0.2～0.8范围内线性较好），还原糖的量与反应液的颜色强度（吸光度OD值）呈线性关系，利用分光光度仪，以分析纯葡萄糖为还原糖测定的标准品，在540nm处按梯度依次测定各葡萄糖浓度对应的反应液的吸光度（OD值）大小，通过微机处理数据，定制葡萄糖标准曲线，确定出3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖的线性回归方程；

2. 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定马铃薯总糖含量测定的原理

先将马铃薯去皮，经机械粉碎，过滤和清水漂洗，烘干制成马铃薯淀粉；再精确称取干燥恒重后的马铃薯淀粉加酸水解为还原糖，经中和定容，配制成马铃薯总糖含量测定的待测液（即样品液）；再以标准曲线测定的加样操作方法，测定出样品待测液的吸光度大小，将测定的吸光度大小代入其回归方程，即可计算出样品待测液的显色浓度，根据稀释倍数关系，计算出以还原糖的量表示的马铃薯总糖的量，并测定出马铃薯总糖百分含量。该方法是半微量定糖法，操作简便，快速，杂质干扰较少。

实验操作

1. 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法定制葡萄糖标准曲线

（1）葡萄糖标准溶液的配制：（2mg/mL）准确称取2000mg分析纯的葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至1000mL，冰箱保存备用

（2）葡萄糖标准曲线定制加样操作及测定结果纪录（详见表1）

按表1进行实验操作，在沸水浴中准确反应20min，取出后立即用冷水冷却，加蒸馏水定容至25mL，摇匀，用lcm的比色杯于540nm处测光密度值。并记录A540nm处测得的各浓度及样品对应的OD值。

（3）葡萄糖标准曲线定制微机数据处理和回归方程（详见表2）及标准曲线的绘制见图1

2. 马铃薯总糖含量测定操作

（1）马铃薯淀粉的制备（此处略，学生实验报告需补充完整）

（2）马铃薯淀粉水解待测液配制（2mg/mL）准确称取干燥恒重后的自制淀粉250mg，加入100mL

蒸馏水和2mL20%硫酸，在沸水浴中加热水解，直到水解彻底后，用20%氢氧化钠溶液中和，至pH = 6.8～7.0后，将反应液转入250mL 容量瓶中，补加蒸馏水定容至250mL ，配制成浓度为2mg/mL 的淀粉水解后，即总糖测定的样品液，冰箱保存备用。

（3）马铃薯淀粉水解待测液还原糖测定（操作方法详见表1）

表1 3,5-二硝基水杨酸法定制葡萄糖标准曲线实验加样操作记录表 试管编号

012345678样1样22000ug/mL 葡萄糖标准溶液/ mL 0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00 1.20

1.40

1.60

1.00

1.00

3,5-二硝基水杨酸（mL ）蒸馏水（mL ）

2.00

1.80

1.60

1.40

1.20

1.00

0.80

0.60

0.4

2.0mL 立即摇匀放入沸水浴中准确反应10min

取出后用自来水冷却，用蒸馏水定容至25mL 后，以0号试管为空白对照，在540nm 处比色测定OD 值。

表2 3,5-二硝基水杨酸法定制葡萄糖标准曲线数据处理统计表

01234567

8

0.016.0

32.0

48.0

64.0

80.0

96.0

112.0128.0

0.000.0840.1700.2510.3140.3900.4640.5260.5980.01

0.0890.1630.2370.3110.3850.4590.5330.607

样1

样2

0.3630.372

实验数据的相关性因素( r )

线性回归方程斜率 (b)线性回归方程截距 (a)线性回归方程

试管编号

标准葡萄糖显色浓度 ( ug / mL )回归方程对应浓度下的吸光度A 540nm 实验测试的吸光度0.004630.01444

y = 0.00463x + 0.01444

0.9990

3. 马铃薯总糖的测定

（1）待测淀粉水解液显色浓度的计算：将样品水解液与DNS试剂反应后测得的吸光度大小，代入

（ug/mL）。

葡萄糖（还原糖）标准曲线对应的回归方程中，计算出水解液的显色浓度x

显色

（0.372 + 0.363）/2 = 0.00463 x

显色+ 0.01444

x显色= [（0.372 + 0.363）/（2×0.00463）－0.01444 ]= 1983.5（ug/mL）

的计算：

（2）待测淀粉水解液中还原糖浓度x

水解

x水解= [（0.372 + 0.363）/（2×0.00463）－0.01444 ]×25 = 1983.5（ug/mL）（3）马铃薯总糖百分含量（以还原糖表示，马铃薯淀粉提取率若为8.33%）

则马铃薯总糖百分含量w为：

w =(x水解/x样品) ×8.33% =（1983.5 / 2000 ）×8.33% = 8.26%

以下报告内容此处略（学生实验报告需补充完整）。

实验结果分析

思考题