基因工程及其在医药学中的应用.

酶切电泳鉴定
菌落原位杂交
目录
（二）工具酶
限制性核酸内切酶
DNA聚合酶Ⅰ DNA连接酶 逆转录酶 碱性磷酸酶 末端转移酶
Taq DNA聚合酶
1.限制性核酸内切酶
(restriction endonuclease, RE)
(1) ຫໍສະໝຸດ Baidu义
识别DNA的特异序列, 并在识别位
点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
GCCTAG+ GATCGC 粘端切口
同功异源酶
来源不同的限制酶，但能识别和切 割同一位点，这些酶称同功异源酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG +GATCGC
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
穿梭载体（shuttle vector)
这类载体中含有来源不同的复制子结构， 即具备原核细胞复制所需的序列结构，又具 有能使外源片段在真核细胞表达所需的结构 元件和相应的选择标记基因,所以能在两种受 体细胞中复制并检测，克隆的外源基因在此 类载体直接从一种受体转入另一种受体中进 行复制和表达．
3.载体具备以下条件: 1.具有自我复制能力 ２．具有多个单一限制性酶切位点
基因工程及其在医药学中的应用
重组DNA技术
DNA Recombination Technique
本章主要内容
◆基因工程相关概念 ◆基因工程相关的酶学 ◆基因工程的载体 ◆目的基因的制备和分离方法 ◆载体与目的基因的连接 ◆重组体的鉴定与分析 ◆隆基因的表达
重组DNA技术的发展史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
G CCTAG
+
GATCC G
ATCTAG+GATCTA
2. DNA聚合酶Ⅰ
①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端
3.TaqDNA聚合酶
(TagDNA polymerase)
◆具有λ噬菌体 粘性末端特性 ◆具有质粒耐药性标记 ◆具有多个限制性酶切位点 ◆具有高容量的克隆能力 ◆接上真核细胞复制子和启动子及选择标记， 就能在真核细胞中存在和表达．
其它
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)
细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)
pUC质粒优点：
１．具有更小的分子，更高的拷数 ２．适于组织化学检测重组体． ３．
噬菌体(phage)
噬菌体(phage)载体系统分类：
◆λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）
◆M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列
动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒， 腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
（四）目的基因
• cDNA (complementary DNA) • 基因组DNA (genomic DNA)
（一）目的基因的获取
1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列 或其产物的氨基酸序列 。
2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)（见第22章）
引物
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
目录
cDNA 文 库
在文库中筛选目的基因原理
• 基于核酸杂交的筛选; • 基于抗原抗体反应的筛选。
聚合酶链反应获取
(polymerase chain reaction, PCR)
PCR基本工作原理
Template DNA
5 5
5
Primer 1
３．具有选择性遗传标记 ４．分子量小，拷贝数高． ５．具有较高的遗传稳定性
◆克隆载体必需结构:
松弛型的复制子、多克隆位点、 筛选标记.
常见:质粒、噬菌体
◆表达载体结构特点：
具有复制子，筛选标记，位于多 克隆位点的上下游具有转录效率 较高的启动子，起始密码子和核 糖体结合位点，转录终止子结 构．
质粒 (plasmid)
是一种耐热的依赖于DNA的D NA聚合酶，具有５‘→３’聚合酶 活性，该酶最适反应温度为75 ° ～ 80 °
4.逆转录酶
①合成cDNA ①替代DNA聚合酶I进行填补，
标记或DNA序列分析
5. Klenow片段
(1)具有完整DNA聚合酶I的53聚合、 35外切活性，而无53外切活性.。 常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3
细胞核全能性
3. DNA克隆
应用酶学的方法，在体外将各种来源的 遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制 能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而 通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的 基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得 大 量 同 一 DNA 分 子 ， 也 称 基 因 克 隆 或 重 组 DNA (recombinant DNA) 。
化学合成获取目的基因
* 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
分子文库
基因组DNA文库获取目的基因 (genomic DNA library)
组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶
基因片断 克隆载体
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
* 从基因组DNA文 库获取目的基因
制的限制，在宿主细胞中拷贝数低约１～３ 份拷贝．
◆松弛型（relaxed plasmid): 复制不受宿主染色体复制的
限制可独立复制，在宿主细胞中拷 贝数高．基因工程常用载体．
常用质粒载体种类： pBR322 pUC
pBR322:人工构建重要质粒
优点：具有较小的分子量． 具有两种抗生素抗性基因，可作 为筛选标记． 具有高拷贝数． 是松弛型质粒．
cos L
~20 Kb 外源 DNA 片段
R cos
连接反应
体外包装
用重组噬菌体 感染大肠杆菌
基因文库
目录
cDNA文库获取目的基因 (cDNA library)
* 从cDNA文库获取目的基因 mRNA 反转录酶
cDNA 复制
双链cDNA 载体
重组DNA分子 受体菌
cDNA文库
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
粘性末端连接
方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接
① 概念: 存在于细菌染色体外的能独立复制
的双链闭环的DNA分子。
②质粒特点:
◆分子量相对较小，能在细菌内稳定存在 ◆能在宿主细胞内独立自主复制 ◆具有某些遗传标志, 会赋予宿主细胞一些
遗传性状； ◆具有多个限制酶的单一位点（多克隆位点）
细菌质粒
质粒的复制类型
◆严谨型（strigent plasmid)： 复制与宿主染色体同步受宿主染色体复
末端标记等.
6. DNA连接酶 (DNA ligase)
功能:催化DNA中相邻的5´磷 酸基和3´羟基末端之间形成 磷酸二酯键，使DNA切口封 合或使两个DNA分子或片段 连接.
7. 多聚核苷酸激酶
功能:催化多聚核苷酸5´羟基 末端磷酸化，或标记探针.
8.末端转移酶
功能: 在3´羟基末端进行种核 苷酸多聚物加尾
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
(4)Ⅱ类酶识别序列特点——
回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
（三）目的基因
cDNA (complementary DNA)
基因组DNA (genomic DNA)
9.碱性磷酸酶
功能: 切除5’末端磷酸基团
（三）基因载体 (cloning vector)
1.概念： 携带目的基因，实现其无性
繁殖或表达有意义的蛋白质所采 用的一些DNA分子。
2. 常用载体:
来源分类：质粒载体 噬菌体载体 病毒载体 人工染色体载体
用途分类：克隆载体 表达载体 穿梭载体
克隆载体(cloning vector)
能使插入的外源DNA序列被复制、扩增 而不能表达，这样的载体为克隆载体。
表达载体(expression vector)
使插入的外源DNA序列转录翻译，表达 出多肽链，这样的载体称为表达载体。
λ噬菌体DNA改造系统
插入单一酶切位点或 一对内切酶位点
５ ‘
左臂
非必需序列
５ ‘
右臂
左臂
右臂
左臂 右臂
不能包装的病 毒颗粒
重组分子
左
右
臂
臂
粘性质粒(cosmid)
粘性质粒(cosmid)：
结合质粒克隆载体和λ噬菌 体克隆载体的优点．
结构：质粒DNA接上λ噬菌体
粘性末端(cos).
粘性质粒的特点
目录
pUC质粒特点：
１．来源于pBR322质粒的复制起 始点
２．具有两种抗生素抗性基因，但基因 内无核酸内切酶位点
３．含有大肠杆菌β－半乳糖苷酶α-肽 段编码基因统称LacZ’基因
４．靠近LacZ’基因５‘端有一段多克隆位点， 影响LacZ’基因功能
５．含有一个调节 LacZ’基因表达 的阻遏蛋白基因LacI
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
(2) 分类、作用
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
与甲基化酶共同构成细菌的限制 修饰系统：限制外源DNA，保护自 身DNA，稳定细菌遗传性状。
(3)命名
EcoRⅠ
属种 株 序
Escherichia coli RY13株
大肠杆菌 RY13株的第一种酶
程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉
一、重组DNA技术相关概念
（一）DNA克隆 1. 克隆(clone)
来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
2.克隆化(cloning)
获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
DNA克隆目的:
① 分离获得某一感兴趣的基因或
DNA; ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋
白质）。
重组DNA技术操作的主要步骤
载体
目的基因（外源基因）
质粒 噬菌体 病毒 基因组DNA
限制酶消化
开环载体DNA
cDNA 人工合成 PCR产物
目的基因
连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
5 Primer 2
Cycle 1
5 5
5 5
Cycle 2
5 5
5
5
5
5
5 5
目录
Cycle 3
5
5 5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
目录
PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸 72˚C
技术水平:
(1)分子克隆(molecular clone),即DNA 克隆 ; (2)细胞克隆； (3)个体克隆（动物或植物）。
细胞的分化潜能
全能性(totipotency) 一个细胞在一定条件下具有发
育成完整个体的潜能，称为细胞 的全能性(totipotency)。具有这种 潜能的细胞称为全能性细胞。
退火
Tm-5˚C
PCR体系基本组成成分
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
（五）目的基因与载体的连接
连接原理
经限制酶作用于目的基因与载体 DNA，在连接酶催化下，来源不同双 链DNA片段，断端重新形成３‘，５’ －磷酸二酯键的过程．
连接方式：
◆粘性末端连接 ◆平端连接 ◆一端粘性末端与另一端平端连接
基因组DNA文库 存在于转化细胞内
由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合
目录
EcoR I
Genomic Library
Infect cells
限制酶切位点
cos L
R cos
限制酶消化
除去中间片段
cos L
R cos
左臂
右臂
真核生物染 色体DNA
限制酶部分消化
~20 Kb DNA 片段
外源DNA与载体DNA混合