MTI2和Bt转基因拟南芥的鉴定及筛选

内蒙古农业大学

硕士学位论文

MTI2和Bt转基因拟南芥的鉴定及筛选

姓名：王晓娟

申请学位级别：硕士

专业：作物遗传育种

指导教师：于卓;杨丽梅

20070501

１８ＭＴｌ２和Ｂｔ转基因拟南芥的鉴定及筛选

试验设定了７个卡那霉素浓度梯度，分别为：５０、１００、２００、３００、４００、５００１１１９／Ｌ。由表ｌ可见，卡那霉素对试验材料的发芽率没有显著影响，而对幼苗白化率有显著影响，随着浓度的增大，幼苗白化率逐渐增高。说明卡那霉素不影响种子萌发却能抑制芽的生长。当浓度达到３００ｍｇ／Ｌ时，未转化基因的野生型拟楠芥种子３个处理全部白化，无一株成活的绿茁，而转基因Ｔｌ代种子仍有部分幼苗正常生长。本试验采用的卡那霉素筛选浓度定为３００ｍｇ／Ｌ。

图２卡那霉素浓度从左至右分别为５０、２００，３００ｍｇ／Ｌ时对照Ｃｏｌｏｍｂｉａ筛选２０ｄ的表现Ｆｉｇ．２Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｎｏｎ·ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｓｅｅｄｓｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙｋａｎａｍｙｃｉｎ

表５ａ００ｍｇ／Ｌ卡那霉素对ＴＩ代种子筛选结果

Ｔａｂｌｅ５ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆＴ５ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｅｄｓｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙｋａｎａｍｙｃｉｎ３００ｍｇ／Ｌ

图３卡那霉素浓度３００ｍ∥Ｌ时Ｔｓ代转基因种子和未转化亲本筛选２０ｄ时的对比

Ｆｉｇ３ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆＬｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｏｅｄｓａｎｄｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｓｅｅｄｓ∞ｌｅ，ｃｔｅｄｂｙｋａｎａｍｙｃｉｎ

内蒙古农业大学硕士学位论文１９将试验中得到的Ｔｌ代８７株抗性苗编号移栽到苗钵中，在人工气候培养室培养。待到收获时严格单株收获种子，即Ｔ２代种子。继续用３００ｍｇ／Ｌ的卡那霉素进行筛选，直到抗性不再发生分离时，结束试验。试验中，在Ｔ３代就已经有全部呈现抗性的材料出现，后又对其进行了两代筛选，确保抗性基因达到了纯合。

对转ＭＴｌ２基因的Ｔ５代材料在卡那３００ｍｇ／Ｌ下进行２０ｄ的筛选，全部生长正常，而对照全部死亡，说明Ｔ５代材料抗性基因已经得到纯合（筛选结果见图３和表５）。

３．２抗性植株的ＰＣＲ检测结果

３．２．１ＤＮＡ提取结果

取幼嫩新鲜的叶片，采用ＣＴＡＢ微量法提取基因组ＤＮＡ，所提ＤＮＡ经１％琼脂糖凝胶电泳检测（凝胶成像结果见图４），条带清晰，无降解，多糖与蛋白质含量少，ＲＮＡ消化彻底，ＤＮＡ的质量符合ＰＣＲ检测的要求。

图４洲＾检测结果

Ｆｉｇ，４ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅｏｎＩ％ａｇｇｒｏｓｅｇｅｌ

泳道ｌ～２为ｍＮＡ，分别是５０ｒｉｇ和１００ａｇ，其他为单株系的ＤＮＡ。

３．２．２ＰＯＲ扩增结果

图５ＰｅＲ扩增结果

Ｆｉｇ．５ＧｅｎｏｍｅＤＮＡＰＣＲｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｐｌａｎｔｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈＭＴｌ２

１．ＭａｒｋｅｒＩＩ；２．未转化的阴性植株对照；３，阳性质粒对照；４～１２．转化植株

２０盯１２和Ｂｔ转基因拟南芥的鉴定及筛选

提取Ｔ６代抗性植株的基因组ＤＮＡ，根据ＭＴｌ２基因的ｃＤＮＡ序列设计特异引物Ｒｗ－ＭＴｌ２和Ｒｅｖ－ＭＴｌ２，以含有相应插入片段的质粒ＤＮＡ作阳性对照，以野生型拟南芥基因组ＤＮＡ作阴性对照，进行ＰＣＲ检测。

本试验共对１００株卡那筛选呈抗性的植株进行了ＰＣＲ扩增，全部扩增出与阳性对照扩增产物大小一致３００ｂｐ的特征带，未转化的阴性对照无此特征带出现（结果见图５）。

３．３抗虫性生物测定结果

对两种转基因材料的抗虫性评价，试验从对害虫的致死率和对害虫生长延缓抑制两方面进行分析。

围６转ＭＴｌ２基因拟南芥生物测定照片

Ｆｉｇ．６ＴｈｅｐｈｏｌｏｏｆＢｉｏａｓｓａｙｒｅｓｕｌｌｓｗｉｔｈＥｘｙｌｏｓｔｅｌｌａｌａｒｖａｅｏｆｎｏｒｍａｌ（ｗｓ）ａｎｄｔｒａｎｓｇｃｎｉｃＭＴｌ２ｐｌａｎｔｓｌｅａｖｅｓＩ、２分别是试验２４ｈ后对照材料ＷＳ和转ＭＴｌ２基因材料ＴＦ３８叶片被咬食状况；３、４分别是试验３ｄ后对照材料ＷＳ和转ＭＴｌ２基因材料ＴＦ３￥叶片被咬食状况

２２ＭＴｌ２和Ｂｔ转基因拟南芥的鉴定及筛选

３．４转Ｂｔ拟南芥回交后代的抗虫性鉴定结果

用野生型拟南芥ＷＳ做对照，对转ｐＴＣｌ２基因材料、回交第一代材料、回交第二代材料进行抗虫性鉴定。因转ｐＴＣｌ２基因拟南芥对一龄小菜蛾幼虫表现出极强的毒杀效果，喂饲３ｄ致死率达到１００％，故此试验中接种的小菜蛾幼虫为二龄幼虫。结果显示，转ｐＴＣｌ２材料和回交第一代的毒性都很强，试验中叶片上几乎看不到被咬食的痕迹：回交第二代毒性低于回交第一代，植株叶片明显有被咬食的孔洞；对照材料ＷＳ被咬食的程度远远大于回交第二代，说明回交第二代与对照相比仍然有较强的抗虫性。

田８转Ｂｔ基因拟南芥回交后代生物测定照片

ｒｅｓｕｌｔｓｗｉｔｈＰ，ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａｌａｒｖａｅｏｆｎｏｒｍａｌ（ｗＳ）ａｎｄｂａｅｋｅｒｏｓｓｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ｐＴＣｌ２，ＢＣＩ，ＢＣ２）ｌｅａｖｅｓ

Ｆｉｇ．８Ｂｉｏａｓｓａｙ

１．对照材料ＷＳ；２．转Ｂｔ基因材料；３．转Ｂｔ基因材料回交第～代；４．转Ｂｔ基因材料回交第二代

表７可见，随着回交世代增加小菜蛾二龄幼虫的校正死亡率逐渐降低，在回交二

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附图

附图１拟南芥植株照片

ＭＴｌ２和Ｂｔ转基因拟南芥的鉴定及筛选

附图２生物测定时拟楠芥照片

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附图３拟南芥回交授粉植株及拟南芥花序照片

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作者：王晓娟

学位授予单位：内蒙古农业大学

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