实验1大肠杆菌的培养和分离

摇床
（三）平板划线分离法
主要器具：接种环、 恒温培养箱。
操作过程：
注意：在作第二次以及其后的划线操作时，要从 上一次划线的开始____末__端__划线。
每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。 思考：若如上图所示进行划线分离，则接种环总 共进行几次灼烧灭菌？ 将培养皿_倒__置___（盖在下），放于_３__７__℃恒温培养 箱中培养_１__２__～__２__４_小时。 无菌操作方法：同前。
2、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？ 为什么？
划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的 菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
3.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
4.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从 上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每 次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划 线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁 殖而来的菌落。
一、基础知识：
（二）培养基 培养基（培养液）是由人工方法配制而成
的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。
1.培养基的类型和用途
（1）按物理状态分：固体培养基和液体培养 基、半固体培养基。 （2）按功能分：选择培养基和鉴别培养基。 （3）按成分分：天然培养基和合成培养基。
液体培养基：
表面生长
均匀混浊生长
④灭菌 高压蒸气灭菌法
1）加水： 向外层锅内加入适量的水，加水的要求是不__触__及__内__胆_.
2）装锅：物品放置的要求_整__齐__、__稳__定__、__留__出__空__隙___：
加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_排__气__槽__内。 再以_两__两__对__称_方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺
5、如何判断接种操作是否符合无菌要求？ 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一 致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是 符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明 接种过程中，无菌操作还未达到要求。
（四）稀释涂布平板法
主要器具：玻璃三角刮刀、移液管或吸管 操作过程： 先将培养菌液稀释（10-5~10-7倍） 用移液管或吸管取0.1ml稀释度不同的菌液，加 在平板上，用无菌玻璃三角刮刀均匀涂布在培养 基平面上。在适当稀释度下，可培养得到相互分 开的的菌落。 将培养皿倒置（盖在下），放于３７ ℃恒温培养 箱中培养１２～２４小时。
菌落的概念
菌落：单个或少数细菌在固体 培养基上大量生长繁殖时，所 形成的肉眼可见的具有一定形 态结构的子细胞群体。
大肠杆菌
不同微生物形成的菌落具有不同 大肠杆菌菌落： 的特征，是鉴定菌种的重要依据。白色或乳白色，光滑
如菌落的大小、形状、边缘、光泽度、颜色、透明度等。
酵母菌
放线菌
霉菌
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠 体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环 境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才 死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水 分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.
革兰氏___阴___（填阴或阳）性菌 代谢类型： 异养，兼性厌氧型 生长适宜温度： 37℃左右
分布：人和哺乳动物肠道，此外还广泛分布于水、 污水、土壤、谷类、乳制品等当中。 大肠杆菌在人体的_肠__道__中一般对人体无害，但任何 大肠杆菌如果进入_泌__尿__系__统___都会对人体产生危害。 大肠杆菌是__基__因___工程中被广泛采用的工具。 质粒、 EcoRⅠ限制酶、E.coli-DNA连接酶、受体细胞
（二）液体培养基接种培养
主要器具：接种环、摇床等 操作方法：先将接种环进行_灼__烧__灭菌, __冷__却__后 的接种环挑取少量菌种，放入三角瓶的液体培养基 中，加塞。置于３__７__℃摇床振荡培养１２小时。
无菌操作：略
思考：如何冷却接种环？ 可通过接触试管内壁或未 长菌的培养基达到冷却的 目的。
栓松紧一致，勿使漏气。
3）加热排气：打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的 冷空__气_____。待_冷__空__气__完__全__排__尽____后，关上排气阀。
4）保温保压：当锅内压力升到____1___kg/cm2时，控制 热源，维持压力至_1__5___min。
5）出锅：切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压 力降至_0___时，打开__排__气__阀__，旋松螺栓，打开 盖子，取出灭菌物品。
加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的 培养基:
分离杂交瘤细胞
合成培养基:
根据细胞生存所需物质的 种类和数量，用人工方法模 拟合成的。
合成培养基主要成分是 氨基酸、维生素、碳水化合 物、无机盐和其它一些辅助 物质。
优点：标准化生产，组分 和含量相对固定;成本低
缺点： 缺少某些成分，不 能完全满足体外细胞生长需 要。
划线分离方法简单；涂布分离，易形成单菌落， 但操作复杂些。
稀释涂布法
10g土样 从土壤中分离微生物
（五）斜面接种及菌种保存
主要器具：接种环、恒温箱、冰箱
操作过程：在无菌操作下，用接种环挑取_单__菌落， 再用划线法（自斜面底部向上轻轻划直线）接种 在_斜__面__上， _３__７__℃恒温培养箱中培养_２__４_小时 后，__４__℃ 冰箱保存。
血清中含有： ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、 铁蛋白等） ②多种金属离子； ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析 球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
培养基的用途 液体培养基：增菌，常用于发酵工业
固体培养基：增菌，菌种保存及分离纯化、 鉴定菌落、活菌计数等
半固体培养基：动力检测，保种
倒平板：待培养基冷却至__６__０_ ℃时，将每只培 养皿倒入_1_0_～__1_2___ml未凝固的固体培养基，置 于_水__平__位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底 部，待凝，使之形成平面。_倒__置____备用。 制斜面：将未凝固的固体培养 基的试管_斜___放，冷却待凝使即 成为斜面。
思考题： A、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？ 1、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打 开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌30分钟。 2、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。 3、整个操作在酒精灯火焰旁进行 4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。
2、流程
计算称量 溶解 调pH 分装
加塞，包扎 灭菌
倒平板
①分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在 将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用_三__角__漏__斗___。 ②加塞：试管用塑料盖或_棉__花__塞___；三角瓶口用_封__口__膜__ 或_6_层__纱__布___封口,再用_牛__皮__纸____或报纸封口。 ③包扎：用牛__皮__纸____或报纸
平板划线的操作方法
➢ 交叉划线法 ➢ 连续划线法
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧 接种环？
操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可 能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环 是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种， 使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划 线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时 菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。
实验1： 大肠杆菌的培养和分离
一、基础知识： (一)微生物
病毒 细菌
微生物包括哪五类： 放线菌
真菌
原生生物
病毒界 原核生物界
真菌界 原生生物界
特点：结构简单,形体微小.通常要用光学显微镜或 电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且 体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.
大肠杆菌（E.coli）
无菌操作：同前
思考：菌种保存为何采 用斜面而不是平板？ 试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多,不容易 进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。
菌种的保存
1、临时保藏： 接种到固体斜面培 养基，菌落长成后 置于4℃冰箱保存。
2、长期保存： 甘油冷冻管藏法
思考题？
利用培养基技术不仅可以分离微生物，也可 以进行植物组织培养。请简要说明这两项技 术应用设计思路的相同点以及区别。
洒精灯灼烧灭菌 接种环等金属器具
干热灭菌
需要保持干燥 耐高温的玻璃金属器皿 160-170 ℃下加热1-2h
3.ຫໍສະໝຸດ Baidu用的消毒与灭菌的方法
(2)消毒的方法：
1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min 3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔 灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4、紫外线消毒 ……
B、培养基灭菌后，需要冷却到60后才倒平板，你 用什么办法来估计培养基的温度呢？ 可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的 温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
思考题
C、为何要将平板倒置？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基 表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养 基面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠 落培养基，造成污染。 D、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在 皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微 生物吗？为什么？ 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上 滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。 E、如何检查培养基是否受杂菌的污染？ 将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生 则未受杂菌污染。
灭菌：使用强烈的理化因素消灭物体内外所有微生 物，包括芽孢和孢子。
比较消毒与灭菌
比较 理化因素的作 消灭微生物的数 芽孢和孢子能否
项
用强度
量
被消灭
消毒 灭菌
较为温和
部分生活状态 的微生物
强烈
全部微生物
不能
3、常用的灭菌和消毒的方法
（1）灭菌方法：
高压蒸汽灭菌 （湿热灭菌）
培养基、无菌水、 各种耐高温的玻璃金属器具 100kPa、121 ℃下维持15-30min
否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差 可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而 发生污染，甚至使容器爆炸。
灭菌后，通常将实验用具放入60℃~80 ℃_烘__箱__ 中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起_污__染__。
⑤倒平板、制斜面
操作平台：超净台 灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开 __紫__外__线___和___过__滤__风____，灭菌30min.
防止__杂__菌____污染的方法。 _各__种__器__具__必须无菌、
主要包括：__培__养__基___也必须要无菌、 _转__移__菌__种____时不能带入其他杂菌
2.消毒与灭菌的概念及两者的区别
消毒：使用较温和理化因素，仅杀死物体表面或内 部的一部分对人体有害的微生物的过程。不能杀死 芽孢和孢子。
沉淀生长
固体培养基：菌落，菌苔
半固体培养基：
无动力
有动力(弥散)
(是否运动)
选择培养基
加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌
不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌
不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物
加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞
2、成分
水、碳源、氮源、 无机盐、生长因子 (生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的 化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶) 不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 调节pH 真菌：5～6 细菌：6.5 ～ 7.5
有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压
四、无菌操作
1.无菌操作的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有
天然培养基：
天然培养基有血清、 血浆、和组织提取液 （如鸡胚和牛胚浸 液）。 优点：营养成分丰富， 培养效果好 缺点：来源受限;成分 复杂，影响对某些实 验产物的提取和实验 结果的分析;易发生支 原体污染;
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和 繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。 如果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
二 操作步骤
（一）制备LB培养基（通用的细菌培养基）
1、配方：蛋白胨0.5克，酵母提取物0.25克， 氯化钠0.5克，水50ml （配固体培养基再加琼脂1克）