显微成像方法与技术2-1
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（十）激光扫描共聚焦显微境
激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM）在荧光显微
镜成像基础上加装激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外或可见光激发 荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察Ca 、 pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物学、神经科 学、药理学、遗传学等领域中强有力的研究工具。 随着计算机、光学显微镜、大数值孔径物镜、高分辨率分析显示、激光源、激光功率 、高敏感度探测器、声光转换电子控制和各种荧光标记物的发展，使得LSCM向更精、
荧光显微镜与激光共聚焦显微镜的区别
non confocal
confocal
激光共聚焦扫描显微镜的特点
1. 可对样品进行非侵入性无损断层扫描，即“光切片”（optical sectioning），最薄可达 0.28微米； 2. 可三维重建，重现立体图像，还可在不同的观察方向对不同深度层次的样品成象；
激光扫描共聚焦显微镜的功能
1.无损伤光学切片，显微“CT”：共聚焦成像利用照明点与探测点共轭这一特性，可有效 抑制同一焦平面上非测量点的杂散荧光及来自样品中非焦平面的荧光，从而获得普通光镜 无法达到的分辨率，同时具有深度识别能力（最大深度一般为200~400µ m）及纵向分辨率， 因而能看到较厚生物标本中的细节。 植物细胞原生质体的显微“CT”
受体漂白技术
荧光受体漂白技术是用来验证两种荧光生色团之间有无FRET发生的的技术。以CFP/YFP为 例，当CFP和YFP靠近到一定程度，如果要验证他们之间有无FRET发生时，可以514nm激光
特异性的激发YFP（FRET受体）荧光，使之发生光漂白，那么此时如果观察到CFP的强度有
明显的上升，则说明CFP和YFP之间有FRET发生，反之则没有。
3. 排除焦点外模糊，成象更加清晰，改善水平分辨率，可达0.10-0.14微米。
激光扫描共聚焦显微镜的设计特点
1.点照明； 2.具有照明pinhole和探测pinhole； 3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点 所在的平面为共焦平面； 4.具有扫描系统——逐点扫描成像； 5.具有多个荧光通道，可同时探测多个被标记物的荧光。
下步进移动，这样细胞或组织各个横断面的图像都能清楚
地显示，实现了“光学切片”的目的。
共聚焦的原理
从激光器出来的激发光被主二色分光镜（分色 镜）反射并被显微镜物镜聚焦到样品上。焦点 处的激发强度最大，但整个光锥内的荧光染料
都被激发了，无论是焦平面上部还是焦平面下
部的染料分子都发射出荧光。从样品返回的光 被物镜收集并聚焦到一个微小的光阑即针孔上。 针孔所在的平面是样品焦点所在的平面的共轭 面（即共焦），只有从样品焦点处出来的光才 能通过针孔并被针孔后的光电倍增管（PMT） 探测到。从焦平面之上或下发出的光就被针孔 有效的阻挡了。因此，焦点的图像极大的排除 了散射光的干扰。通过精确控制的振镜使聚焦 激光逐点扫描样品，从而获得样品某一光学切 面的图像。
4.时间序列扫描（xy-t 、xyz-t 和 x-t 扫描）：即动态观察，在同一样品平面上 随时间进行连续扫描，可分析细胞结构、内含、和标记等动力学变化。
5.感兴趣区域扫描：可选择视野中某一感兴趣的区域进行扫描或漂白操作。
GFP：EX 488nm，EM 500-550nm Bleach：488nm
（Hoeschst、DAPI） 氦-氖激光器（He-Ne）：633nm（叶绿素、MitoTracker Doeep Red、DsRed）
氦-氖激光器（He-Ne）：543nm（DsRed）
氪离子激光器（Kr ）：紫外—可见区，647nm（叶绿素） 倍频氖激光器（YAG）：532nm
+
激光光源的特点
BIO-RAD MRC600 LSCM系统扫描头结构示意图
MRC600 LSCM系统中使用BHS或GHS滤光块时光路的特点
激光光源
氩离子激光器（Ar ） ：458nm（CFP）；488nm（FITC、GFP、Fluo-3）； 514nm（罗丹明123、TEXAS红、YFP、Fluo-3）
+
氦-镉激光器（He-Cd）：442nm（丫啶橙、荧光素、福尔根-希夫试剂）；325nm
借助于高强度激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的光淬灭（即漂白），该区
域周围的非淬灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散，这个扩散速率可通过低强度 激光扫描探测，因而可得到活细胞的动力学参数。
检测细胞连接间的信息传递
荧光漂白恢复过程的观测
GFP：EX 488nm，EM 500-550nm，Bleach：488nm
则能量转移效率也愈大。
例如，研究蛋白质A和B的相互作用时，可构建一融合蛋白CFP-A-YFP。当A与B之间 没有相互作用时，CFP与YFP相距很远，不发生FRET。这时以433nm的光激发能测到
CFP的荧光（476nm）。当A与B发生相互作用时，A受B的作用而发生构像变化，
CFP与YFP充分靠近而发生FRET，此时若以433nm的光激发测到的就是YFP的荧光 （527nm）。因此，测到的荧光变化反映了分子构像的变化，从而反映了蛋白质之间 的相互作用。目前，FRET技术已广泛应用于酶活性、膜蛋白以及活细胞内分子之间相 互作用等研究中。
1) 方向性好：激光器发射的激光光束的发散度极小，大约只有0.001弧度，接近平行
。1962年，人类第一次使用激光照射月球，地球离月球的距离约38万公里，但激光在 月球表面的光斑不到两公里。 2) 单色性好：激光器输出的光，波长分布范围非常窄（=10-8nm）。以输出红光的 氦氖激光器为例，其光的波长分布范围可以窄到2×10-9nm，是氪灯发射的红光波长分 布范围的万分之二。 3) 高亮度：在激光发明前，人工光源中高压脉冲氙灯的亮度最高，而红宝石激光器 的激光亮度，能超过氙灯的几百亿倍。因为激光的亮度极高，所以能够照亮远距离的 物体。激光亮度极高的主要原因是定向发光。大量光子集中在一个极小的空间范围内 射出，能量密度自然极高。 4) 偏振性:激光的频率、振动方向、相位高度一致，使激光光波在空间重叠时，重叠 区的光强分布会出现稳定的强弱相间现象。这种现象叫做光的干涉，所以激光是相干 光。而普通光源发出的光，其频率、振动方向、相位不一致，称为非相干光。
FRET
二、荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after Photo-bleaching，FRAP)
光漂白（photo bleaching）指在光的照射下荧光物质所激发出来的荧光强度随着时间推 移逐步减弱乃至消失的现象。荧光成像的质量很大程度上依赖于荧光信号强度 ，提高激发 光强度固然可以提高信号强度，但激发光的强度不是可以无限提高的，当激发光的强度超 过一定限度时，光吸收就趋于饱和， 并不可逆地破坏激发态分子，这就是光漂白现象。
植物细胞原生质体Z-stack的3D投影图
3.荧光定量、定位分析：激光扫描共聚焦显微镜可对单标记或双标记细胞及组织标本
的共聚焦荧光进行定量分析，并显示荧光沿Z轴的强度变化；同时还可自动将荧光图象 与透射图象重叠以显示荧光在形态结构上的精确定位。激光扫描共聚焦显微镜也非常 适用于高灵敏度的快速免疫荧光测定，可以准确监测抗原表达、荧光原位杂交斑点及 细胞结合和杀伤的形态学特性并作定量分析。
Protein）及其突变体CFP和YFP的应用最为广泛。
荧光共振能量转移的条件
一、能量供体与能量受体分子间的距离要在50～100Ǻ之间； 二、供体的荧光必须与受体吸收光谱要有重叠，重叠愈大转移效率愈高，通常不同分 子间的光谱重叠比相同分子间的重叠（假若有重叠的话）要更大一些；
三、供体必须是发荧光的分子，并且在没有受体存在时，供体的荧光量子效率愈高，
photoelectric multiplier tube）或冷电荷耦合器件
（cCCD，cooled charge-coupled device）逐点或逐线接 收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔 与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面以外的 点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本 的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。 在显微镜的载物台上加一个微量步进马达，可使载物台上
2+
更快、多维和无损伤性分析的方向发展。
激光扫描共聚焦显微镜的基本原理
传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像
都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰；激光扫描共
聚焦显微镜利用激光扫描束经照明针孔形成点光源对标本 内焦平面上的每一点扫描，标本上的被照射点在探测针孔 处成像，由探测针孔后的光电倍增管（PMT，
紫外刺激后FRET随时间变化曲线
A B：ASTC-a-1 cells were transiently cotransfected with YFP-Bcl-XL and GFP-PUMA and then treated with UV irradiation. EX：488nm，EM：GFP 500-520nm，FRET YFP 535-545nm C D：ASTC-a-1 cells were transiently cotransfected with CFP-Bcl-XL and YFP-Bax, followed by UV irradiation. EX：458nm，EM：CFP 470-500nm，FRET YFP 535-545nm
Ex: 488nm
Em: LP650 Pinhole: 168um
Objective: 100X/1.45
Z-stack：0.41um
2.三维图像重建：激光扫描共聚焦显微镜通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义 上的三维数据，经计算机图象处理及三维重建软件，沿X、Y和Z轴或其他任意角度来观察 标本的外形及面，并得到其三维立体结构，从而能十分灵活、直观地进行形态学观察， 并揭示亚细胞结构的空间关系。
CFP：EX 458nm，EM 470-500nm FRET YFP：EM LP530nm Bleach：514nm
三、 Ca2+、pH及其他细胞内离子的实时定量测定
利用Fluo-3、Indo-1、Fura-Red等多种荧光探针，激光扫描共聚焦显微镜可对 单个细胞内各种离子的比例及动态变化作毫秒级实时定量分析；可以定量探测胞
激光刺激后FRET随时间变化曲线
EX：458nm，EM：CFP 470-500nm，FRET YFP 535-545nm
测定Hela活细胞中的Ca2+浓度
Chameleon(变色指示剂)，一种合成蛋白， 由4个部分组成： -CFP -钙调素 （CaM） -缩氨酸（M13） -YFP CaM结合Ca2+后，蛋白构象发生变化，产 生分子折叠，使CFP/YFP相互靠近，产生
质中Ca2+对肿瘤启动因子、化学因子、生长因子及各种激素等刺激的反应；使用
双荧光探针Fluo-3和SNARF可同时测定Ca2+和pH值。
激光刺激后细胞内Ca离子浓度的变化 Fluo-3-AM，EX：488nm，Em：500-550nm
LSM510-ConfoCor2系统介绍
LSM 510-ConfoCor 2系统几大功能：
CFP：EX 458nm， EM 470-500nm FRET YFP：EM LP530nm Bleach：514nm
6.光谱扫描： 可以对荧光样品进行全光谱（400-750）扫描，获得各波段的荧光图像或荧光 光谱曲线。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
激光扫描共聚焦显微镜的应用
一、荧光共振能量转移技术
荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）技术 是近年来出现的一种崭新的技术。荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在 足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后，通过偶极相互作用将能量转 移给邻近的受体分子。利用FRET技术能够定时、定量、定位、无损的研究活 细胞内蛋白质与蛋白质之间的相互作用。其中以GFP（Green Fluorescence
激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM）在荧光显微
镜成像基础上加装激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外或可见光激发 荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察Ca 、 pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物学、神经科 学、药理学、遗传学等领域中强有力的研究工具。 随着计算机、光学显微镜、大数值孔径物镜、高分辨率分析显示、激光源、激光功率 、高敏感度探测器、声光转换电子控制和各种荧光标记物的发展，使得LSCM向更精、
荧光显微镜与激光共聚焦显微镜的区别
non confocal
confocal
激光共聚焦扫描显微镜的特点
1. 可对样品进行非侵入性无损断层扫描，即“光切片”（optical sectioning），最薄可达 0.28微米； 2. 可三维重建，重现立体图像，还可在不同的观察方向对不同深度层次的样品成象；
激光扫描共聚焦显微镜的功能
1.无损伤光学切片，显微“CT”：共聚焦成像利用照明点与探测点共轭这一特性，可有效 抑制同一焦平面上非测量点的杂散荧光及来自样品中非焦平面的荧光，从而获得普通光镜 无法达到的分辨率，同时具有深度识别能力（最大深度一般为200~400µ m）及纵向分辨率， 因而能看到较厚生物标本中的细节。 植物细胞原生质体的显微“CT”
受体漂白技术
荧光受体漂白技术是用来验证两种荧光生色团之间有无FRET发生的的技术。以CFP/YFP为 例，当CFP和YFP靠近到一定程度，如果要验证他们之间有无FRET发生时，可以514nm激光
特异性的激发YFP（FRET受体）荧光，使之发生光漂白，那么此时如果观察到CFP的强度有
明显的上升，则说明CFP和YFP之间有FRET发生，反之则没有。
3. 排除焦点外模糊，成象更加清晰，改善水平分辨率，可达0.10-0.14微米。
激光扫描共聚焦显微镜的设计特点
1.点照明； 2.具有照明pinhole和探测pinhole； 3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点 所在的平面为共焦平面； 4.具有扫描系统——逐点扫描成像； 5.具有多个荧光通道，可同时探测多个被标记物的荧光。
下步进移动，这样细胞或组织各个横断面的图像都能清楚
地显示，实现了“光学切片”的目的。
共聚焦的原理
从激光器出来的激发光被主二色分光镜（分色 镜）反射并被显微镜物镜聚焦到样品上。焦点 处的激发强度最大，但整个光锥内的荧光染料
都被激发了，无论是焦平面上部还是焦平面下
部的染料分子都发射出荧光。从样品返回的光 被物镜收集并聚焦到一个微小的光阑即针孔上。 针孔所在的平面是样品焦点所在的平面的共轭 面（即共焦），只有从样品焦点处出来的光才 能通过针孔并被针孔后的光电倍增管（PMT） 探测到。从焦平面之上或下发出的光就被针孔 有效的阻挡了。因此，焦点的图像极大的排除 了散射光的干扰。通过精确控制的振镜使聚焦 激光逐点扫描样品，从而获得样品某一光学切 面的图像。
4.时间序列扫描（xy-t 、xyz-t 和 x-t 扫描）：即动态观察，在同一样品平面上 随时间进行连续扫描，可分析细胞结构、内含、和标记等动力学变化。
5.感兴趣区域扫描：可选择视野中某一感兴趣的区域进行扫描或漂白操作。
GFP：EX 488nm，EM 500-550nm Bleach：488nm
（Hoeschst、DAPI） 氦-氖激光器（He-Ne）：633nm（叶绿素、MitoTracker Doeep Red、DsRed）
氦-氖激光器（He-Ne）：543nm（DsRed）
氪离子激光器（Kr ）：紫外—可见区，647nm（叶绿素） 倍频氖激光器（YAG）：532nm
+
激光光源的特点
BIO-RAD MRC600 LSCM系统扫描头结构示意图
MRC600 LSCM系统中使用BHS或GHS滤光块时光路的特点
激光光源
氩离子激光器（Ar ） ：458nm（CFP）；488nm（FITC、GFP、Fluo-3）； 514nm（罗丹明123、TEXAS红、YFP、Fluo-3）
+
氦-镉激光器（He-Cd）：442nm（丫啶橙、荧光素、福尔根-希夫试剂）；325nm
借助于高强度激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的光淬灭（即漂白），该区
域周围的非淬灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散，这个扩散速率可通过低强度 激光扫描探测，因而可得到活细胞的动力学参数。
检测细胞连接间的信息传递
荧光漂白恢复过程的观测
GFP：EX 488nm，EM 500-550nm，Bleach：488nm
则能量转移效率也愈大。
例如，研究蛋白质A和B的相互作用时，可构建一融合蛋白CFP-A-YFP。当A与B之间 没有相互作用时，CFP与YFP相距很远，不发生FRET。这时以433nm的光激发能测到
CFP的荧光（476nm）。当A与B发生相互作用时，A受B的作用而发生构像变化，
CFP与YFP充分靠近而发生FRET，此时若以433nm的光激发测到的就是YFP的荧光 （527nm）。因此，测到的荧光变化反映了分子构像的变化，从而反映了蛋白质之间 的相互作用。目前，FRET技术已广泛应用于酶活性、膜蛋白以及活细胞内分子之间相 互作用等研究中。
1) 方向性好：激光器发射的激光光束的发散度极小，大约只有0.001弧度，接近平行
。1962年，人类第一次使用激光照射月球，地球离月球的距离约38万公里，但激光在 月球表面的光斑不到两公里。 2) 单色性好：激光器输出的光，波长分布范围非常窄（=10-8nm）。以输出红光的 氦氖激光器为例，其光的波长分布范围可以窄到2×10-9nm，是氪灯发射的红光波长分 布范围的万分之二。 3) 高亮度：在激光发明前，人工光源中高压脉冲氙灯的亮度最高，而红宝石激光器 的激光亮度，能超过氙灯的几百亿倍。因为激光的亮度极高，所以能够照亮远距离的 物体。激光亮度极高的主要原因是定向发光。大量光子集中在一个极小的空间范围内 射出，能量密度自然极高。 4) 偏振性:激光的频率、振动方向、相位高度一致，使激光光波在空间重叠时，重叠 区的光强分布会出现稳定的强弱相间现象。这种现象叫做光的干涉，所以激光是相干 光。而普通光源发出的光，其频率、振动方向、相位不一致，称为非相干光。
FRET
二、荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after Photo-bleaching，FRAP)
光漂白（photo bleaching）指在光的照射下荧光物质所激发出来的荧光强度随着时间推 移逐步减弱乃至消失的现象。荧光成像的质量很大程度上依赖于荧光信号强度 ，提高激发 光强度固然可以提高信号强度，但激发光的强度不是可以无限提高的，当激发光的强度超 过一定限度时，光吸收就趋于饱和， 并不可逆地破坏激发态分子，这就是光漂白现象。
植物细胞原生质体Z-stack的3D投影图
3.荧光定量、定位分析：激光扫描共聚焦显微镜可对单标记或双标记细胞及组织标本
的共聚焦荧光进行定量分析，并显示荧光沿Z轴的强度变化；同时还可自动将荧光图象 与透射图象重叠以显示荧光在形态结构上的精确定位。激光扫描共聚焦显微镜也非常 适用于高灵敏度的快速免疫荧光测定，可以准确监测抗原表达、荧光原位杂交斑点及 细胞结合和杀伤的形态学特性并作定量分析。
Protein）及其突变体CFP和YFP的应用最为广泛。
荧光共振能量转移的条件
一、能量供体与能量受体分子间的距离要在50～100Ǻ之间； 二、供体的荧光必须与受体吸收光谱要有重叠，重叠愈大转移效率愈高，通常不同分 子间的光谱重叠比相同分子间的重叠（假若有重叠的话）要更大一些；
三、供体必须是发荧光的分子，并且在没有受体存在时，供体的荧光量子效率愈高，
photoelectric multiplier tube）或冷电荷耦合器件
（cCCD，cooled charge-coupled device）逐点或逐线接 收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔 与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面以外的 点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本 的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。 在显微镜的载物台上加一个微量步进马达，可使载物台上
2+
更快、多维和无损伤性分析的方向发展。
激光扫描共聚焦显微镜的基本原理
传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像
都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰；激光扫描共
聚焦显微镜利用激光扫描束经照明针孔形成点光源对标本 内焦平面上的每一点扫描，标本上的被照射点在探测针孔 处成像，由探测针孔后的光电倍增管（PMT，
紫外刺激后FRET随时间变化曲线
A B：ASTC-a-1 cells were transiently cotransfected with YFP-Bcl-XL and GFP-PUMA and then treated with UV irradiation. EX：488nm，EM：GFP 500-520nm，FRET YFP 535-545nm C D：ASTC-a-1 cells were transiently cotransfected with CFP-Bcl-XL and YFP-Bax, followed by UV irradiation. EX：458nm，EM：CFP 470-500nm，FRET YFP 535-545nm
Ex: 488nm
Em: LP650 Pinhole: 168um
Objective: 100X/1.45
Z-stack：0.41um
2.三维图像重建：激光扫描共聚焦显微镜通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义 上的三维数据，经计算机图象处理及三维重建软件，沿X、Y和Z轴或其他任意角度来观察 标本的外形及面，并得到其三维立体结构，从而能十分灵活、直观地进行形态学观察， 并揭示亚细胞结构的空间关系。
CFP：EX 458nm，EM 470-500nm FRET YFP：EM LP530nm Bleach：514nm
三、 Ca2+、pH及其他细胞内离子的实时定量测定
利用Fluo-3、Indo-1、Fura-Red等多种荧光探针，激光扫描共聚焦显微镜可对 单个细胞内各种离子的比例及动态变化作毫秒级实时定量分析；可以定量探测胞
激光刺激后FRET随时间变化曲线
EX：458nm，EM：CFP 470-500nm，FRET YFP 535-545nm
测定Hela活细胞中的Ca2+浓度
Chameleon(变色指示剂)，一种合成蛋白， 由4个部分组成： -CFP -钙调素 （CaM） -缩氨酸（M13） -YFP CaM结合Ca2+后，蛋白构象发生变化，产 生分子折叠，使CFP/YFP相互靠近，产生
质中Ca2+对肿瘤启动因子、化学因子、生长因子及各种激素等刺激的反应；使用
双荧光探针Fluo-3和SNARF可同时测定Ca2+和pH值。
激光刺激后细胞内Ca离子浓度的变化 Fluo-3-AM，EX：488nm，Em：500-550nm
LSM510-ConfoCor2系统介绍
LSM 510-ConfoCor 2系统几大功能：
CFP：EX 458nm， EM 470-500nm FRET YFP：EM LP530nm Bleach：514nm
6.光谱扫描： 可以对荧光样品进行全光谱（400-750）扫描，获得各波段的荧光图像或荧光 光谱曲线。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
激光扫描共聚焦显微镜的应用
一、荧光共振能量转移技术
荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）技术 是近年来出现的一种崭新的技术。荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在 足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后，通过偶极相互作用将能量转 移给邻近的受体分子。利用FRET技术能够定时、定量、定位、无损的研究活 细胞内蛋白质与蛋白质之间的相互作用。其中以GFP（Green Fluorescence