辣根过氧化物酶

戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进
行交联反应。 戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用，形成酶-戊二醛结合 物，结过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结 合。
HRP标记多抗
1、取10mgHRP溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、 pH6.8PB将25%戊二醛稀释为1.25%)，室温（20℃左右）反
9.6），4℃，电磁搅拌下结合24h。 5、加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸（0.29g溶于10mL蒸馏水）， 4℃放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。 6、装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2 PBS，4℃透析过夜，
或通过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1
1:64 1:128 1:32
1:256 1:16
1:2
1:4 1:8
双向琼脂扩散试验测HRP-IgG效价
双向免疫扩散效价最低1∶16
采用直接ELISA法测定酶标单抗效价，以特异显色为 1.0时的稀释倍数作为酶标单抗效价。
直接ELISA法测HRP-IgG效价
直接ELISA效价1∶10000以上
标记抗体质量判定
3、室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜；
4、标记抗体的酶IgG克分子比应介于1~2之间； 5、浓的标记物相当稳定，常加入30～50%甘油于-10℃以下保 存。4℃可保存1～2年，但稀释成1∶10，只能保存数周。已配 制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。
第四节 酶免疫测定技术要点
一、基本概念
酶联免疫吸附试验（ ELISA ）：结合在固相载体上的抗原 （抗体）与待检抗体（抗原）酶偶联物（标记物）反应后， 催化水解或氧化还原酶的相应底物呈色，其颜色深浅与待测 抗原（抗体）含量成正比。 包被（coating）：指将抗原或抗体固相化的过程。它是通过 物理吸附作用，一般靠疏水键连接。 封闭（blocking）：指用封闭剂封闭经包被的固相载体表面 残留的未饱和位吸附位点的过程。 免疫吸附剂（immunosorbent）：固相化的抗原或抗体。
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。目前用
得较广泛和较满意的供氢体是：OPD和TMB。另外
，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基
苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，灵敏度和稳定性均好。 由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶 促反应中使用的H2O2不能过量。
HRP常用底物
ELISA常用的固相载体类型：
聚苯乙烯（PS）硬板
聚氯乙烯（PVC）软板 微孔滤膜(NC膜、尼龙膜) 琼脂糖珠或磁性微粒
对蛋白质有较强的物理吸附性能
蛋白吸附性能高于PS，但非特异性吸附较高 大多数抗原或抗体几乎全能结合到NC膜 共价结合抗原（抗体），结合容量大
标记抗体质量判定
（1）定性及效价滴定：
5～25% 高
异双功能基团交联剂HECCM分别通过其羟 85% 琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基与酶和抗体/ 抗原上游离氨基和巯基结合
（一）过碘酸盐氧化法
原理：是一种糖蛋白,糖链部分无活性，其己糖邻位 -0H可被碱性过碘酸盐氧化成醛基，再与抗体蛋白 中游离-NH2形成schiff碱；酶与抗体结合反应后，
升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg IgG在1ml 0.01M碳酸盐 缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2h。 5. 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃ 2h。
6. 将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃
过夜。 7. 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃ 1h。 8. 3000rpm离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗 二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
应结合18h。
2、用0.15mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱， 除去游离的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析过 夜。 3、将5mg抗体IgG溶于1mL0.15mol/L NaCl，再与醛化HRP
溶液（10mg/mL）混合。
4、加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液（调节pH至9.0～
酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，PH5左右。 HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm ，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ表示酶的纯度。 高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。
HRP酶促反应
酶促反应的过程： HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
再加入硼氢化钠(NaHB4）还原成稳定的HRP-IgG
偶联物。 所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和IgG 结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重 大损失，是目前最常用的方法。
1、HRP标记腹水单抗
过碘酸钠氧化法，HRP直接标记腹水中的单抗
1、5mg HRP溶解于0.5ml 0.1M NaHCO3中； 2、加0.5ml10mM NaIO4，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2h； 3、加0.75ml 0.1M Na2CO3，混匀； 4、加0.75ml 小鼠腹水单抗，混匀； 5、加Sephadex G25干粉0.5g，混匀，盖紧，室温作用3h； 6、用少许PBS将交联物转移于一支下口具玻璃棉的5ml注射器 外筒中； 7、用少许PBS将交联物全部洗出； 8、收集洗出液，加1/20V新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀 ，室温作用30min； 9、再加3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1h；
β-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。
AP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶免疫测定。AP 标记抗体，一般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋 白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。
AP常用底物
底物 pNPP 对-硝基苯磷酸酯 NBT 产物性质 黄色产物----硝基酚 不溶性黑紫色沉淀 主要吸收峰波长（nm） 405nm 免疫印迹
二、酶结合物的制备方法
方法 直接 结合 法 过碘酸盐 氧化法 戊二醛 一步法 交 联 法 戊二醛 二步法 苯二马来 酰亚胺法 异双功能 基团交联 法 原理 酶标记率 70% 过碘酸盐钠氧化酶分子表面多糖羟基成醛基， 与抗体/抗原中游离反应，形成Schiffs碱。 酶和抗体/抗原同时加入戊二醛溶液中，戊 二醛两醛基分别与酶及抗体/抗原上氨基反 应，生成Schiffs碱 酶和抗体/抗原先后分别加入戊二醛溶液中 双功能交联剂PDM通过酶和抗体/抗原中巯 基将两者偶联起来 1～5%
峰洗脱液。 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点：酶的利用率低， 一般只有2～4％的酶与蛋白质结合。
注意事项
1、标记用HRP的RZ值应≥3.0; 2、所使用试剂的pH和浓度及用量必须严格掌握；一般HRP:待 标记物＝2:1到4:1之间。 ；所用试剂，如过碘酸钠氧化法中 的NaIO４和 NaBH４、戊二醛标记法中的戊二醛必需新鲜配制；
10、将交联物过Sephdex G200（2.6×100cm）层析纯化，
分管收集第一峰。
Fig 2-1. Gel filtration of the reaction mixture of HRP conjugated to mAb 13A4 on a Sephadex G200 column（2.6cm×100cm）, equilibrated with PBS, at a rate of 0.15 ml/min and a tube/15 min.
9. 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PBS缓冲盐
水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心 30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物。
（二）戊二醛交联法
原理：戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两 个醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合，形成HRP-戊二 醛-Ab蛋白结合物。
ELISA操作要点：
加样：即加标本、酶结合物和底物，注意交叉污染和产生气泡。 温育：常采用的温度：43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）。 洗涤：是ELISA最主要的关键技术，目的是分离游离的和结合的酶标 记物。洗涤方式自动板机、手工操作（浸泡式和流水冲洗式）。 显色：影响因素：反应温度和时间；OPD底物液应避光显色，硫酸 终止；TMB显色终止液：叠氮钠、SDS、各类酸性终止液。 比色：以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔） 和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔）。
第三节 酶标记物的制备
一、酶制剂及其底物
作为标记抗体用的酶应满足下列要求：
(1) 活性高 (2) 性质稳定 (3) 专一性强 (4) 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 (5) 方法敏感，重复性好，简单易行 (6) 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶 (HRP)和碱性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶， β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP) ， AP:系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水
解酶，由多个同功酶组成。 小牛肠粘膜AP分子量为100kDa，酶作用的最适pH为9.6； 大肠杆菌AP分子量为80kDa，最适pH为8.0。 AP作用底物较多，常用的酶底物有对硝基本磷酸盐(PNP)、
（2）定量和克分子比值测定：分光光度计测定(光程1cm) 酶量(mg/ml)＝OD403nm×0.4 IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm× 0.3)×0.62(过碘酸盐) IgG量(mg/ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62(戊二醛)
其它：酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、碳酸苷酶、溶菌酶和脲酶
Leabharlann Baidu
作为酶标记对象的抗原与抗体要求：
抗原要求纯度高，抗原性完整
抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比
活性较高，能批量生产，易纯化。
制备方法要求：
（1）技术方法简单、产率高，重复性好； （2）标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性； （3）酶标记物稳定 ，不形成聚合物。
辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)
HRP比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备。 HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，由无色的酶蛋白和 棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。
HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,
底物 ABTS OPD 邻苯二胺 TMB 四甲基联苯胺 产物性质 绿色水溶性产物 桔黄色水溶性产物 蓝色水溶性产物 加入硫酸或磷酸，产生黄色 主要吸收峰波长（nm） 410、650 492 370、652 450 免疫组化 免疫印迹、免疫组化 多重染色的第二标记
DAB 不溶性棕色沉淀 3.3－二氨基联苯胺 Chloronaphthol AEC 产物颜色介于蓝色-蓝紫色，易于成像 棕红色沉淀，容易成像
ELISA常用溶液： 包被缓冲液 封闭液 稀释缓冲液 底物缓冲液 终止液 洗涤缓冲液 pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液、pH7.2的磷酸盐缓冲液、 pH7~8的Tris-HCL缓冲液 0.05%-0.5%的牛血清白蛋白、10%的小牛血清、1%明胶、 5%脱脂奶粉 pH7.4 PBST（含0.05%吐温20 ，1%牛血清白蛋白） 0.1M pH5.0磷酸-柠檬酸 2M H２SO４ 0.15M pH7.4 PBST（含0.05%吐温20 磷酸缓冲盐水）
2、HRP标记多抗
1. 称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中。
2. 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅 拌20分钟。 3. 将上述溶液装入透析袋中，对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液 透析，4℃过夜。
4. 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的pH