第五章 序列解读
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动物园杂交（ zoo-blotting)：亲缘关系相近的物
种，基因编码区相似性高，非编码区同源性低，
因此将Baidu Nhomakorabea一物种的DNA顺序与来自另一亲缘种的
DNA片段杂交，如果产生阳性信号，则该区段可
能含有基因。
基因组学
杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和
动物园杂交（Zoo blotting)
基因组学
杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和
正常条件下：
转录因子 （包括两个功能区域）→ 结合功能
域同基因上游的区段结合 → 激活功能域激活
RNA多聚酶 → 将基因转录为mRNA
基因组学
杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和
酵母杂交系统中：
融合表达载体1
DNA结合功能域 +目的片段 表达载体共转化 融合表达载体1 融合表达载体2
融合表达载体2
D ）模拟多肽高级结构相似
孤独基因：缺少同源顺序的ORF。
基因组学
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同源查询（DNA顺序）
同源查询（氨基酸顺序）
基因组学
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同源性、一致性和相似性
1) 同源性基因系指起源于同一祖先但顺序已经发生变异的 基因成员, 分布在不同物种间的同源基因又称直系基因。 同一物种的同源基因则称水平基因。 基因同源性只有“是”和“非”的区别, 无所谓百分比。 2) 一致性系指同源DNA顺序的同一碱基位置的相同的碱基 成员, 或者蛋白质的同一氨基酸位置的相同的氨基酸成 员, 可用百分比表示。 3) 相似性系指同源蛋白质的氨基酸顺序中一致性氨基酸和 可取代氨基酸所占的比例。可取代氨基酸系指具有相 同性质如极性氨基酸或非极性氨基酸的成员, 它们之间 的代换不影响蛋白质(或酶)的生物学功能。
激活功能域+ 多种未知cDNA
同一细胞
形成聚合物，启动 报告基因的表达
干扰cDNA筛选的因素
cDNA丰度低（解决办法：cDNA文库分群、cDNA均 一化） mRNA二级结构（解决办法：高温反转录）
基因组学
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§5 基因组序列解读
§5.2 基因功能预测
基因功能预测：
计算机预 测基因功能
实验确认基因功能
1）基因失活 2）基因过表达
tk 胸苷激酶标记基因 ← gangcyclovir
neor 新霉素抗性基因→G418
基因组学
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转座子突变库构建
转座子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过 切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置 “跳跃”到另一个位置。 1) 利用天然的DNA转座子构建表达载体转化受体细胞, 当转座子活化时可被动转座并随机插入受体细胞基因 组引起基因突变。 2) 将转化的发生转座事件的细胞系再生获得可遗传的 转化子后代, 观测突变再生植株的表型变化, 分离与克 隆插入突变基因的结构与功能。 3) 采用转座子突变技术可重复地大规模诱导和筛选插 入突变株系, 进行全基因组范围的基因功能研究。
基因组学
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密码子偏爱
基因组学
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同源查询
依据：现有生物不同种属之间具有结构或功能相似的 直系基因成员，序列保守。 同源有如下几种情况： A） DNA序列某些片段完全相同； B ）开放读码框（ORF）排列类似，如有长外显子； C） 开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性；
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§5 基因组序列解读 §5.1 寻找DNA序列中的基因 通过序列筛查定位基因 依据： 1) 基因的组成特点 2) 密码子偏爱 3) 同源查询
基因组学
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1) 基因的组成特点
起始密码子：ATG 终止密码子：TAA、TAG、TGA GC% = 50% 终止密码子每 64 bp出现一次； GC% > 50% 终止密码子每100－200 bp 出现一次； 由于多数基因 ORF 均多于50个密码子，因此最可能的 选择应该是 ORF 不少于100 个密码子。
构建反义RNA 表达载体:
将全目的基因或部分目的基因反向插入表达载体 → 转化目标生物 →获得转基因个体或品系 → 分 析转基因植株在生理、生化、形态等方面的变异 → 判别目的基因的功能
基因组学
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反义RNA 作用机理：
A 干扰翻译的起始与延伸，可与翻译起始顺序及编码序
§5 基因组序列解读
§5.1 寻找DNA序列中的基因
A 构建cDNA文库，用目的基因DNA片 段筛选文库。
B 根据已知片段设计引物，RACE 技术
得到基因的全长cDNA序列。
基因组学
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DNA顺序中基因位置的确定
cDNA测序
cDNA与基因编码区对应，包含5’引导顺序和3’结尾顺 序。cDNA与基因组比较可以确定基因所在位置，还可 以找到外显子-内含子边界。
• 不含或含有较少的终止密码
2) 内含子的组成 • 内含子具有前体mRNA加工的特征顺序. • 内含子含有高比例的三种读框的终止密码.
基因组学
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真核生物内含子的出现给计算机判读基因带来了不少 问题，在编写ORF扫描程序时要作出修改加入一些相 应的规则: Codon bias（密码子偏爱）： 是指对于一个特殊 的物种来说，编码蛋白的密码子的使用频率并非都是 相同的。 Exon-intron boundaries（外显子-内含子边界） ： 供体位 5’-AG GTAAGT-3’ 受体位 5’-PyPyPyPyPyPyCAG-3’ Upstream control sequences（上游控制序列） 另外个别生物的基因组特有组成也可作为判别依据， 如脊椎动物基因组许多基因的上游都有CpG岛
列结合形成双链RNA，随之被细胞降解。
B 与mRNA 的引导顺序结合，阻止核糖体的附着，使翻
译无法启动。 C 反义RNA与mRNA形成双链分子后，使RNA多聚酶脱 离模板,转录终止。
基因组学
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基因超表达
通过增加基因的拷贝数和采用强启动子促 使基因超表达,致使受体表现出生长与发育 的异常,来研究基因的功能。
基因组学
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计算机预测基因功能
种间同源基因（直系基因）：不同物种之间的同源
基因，来自物种分隔之前的同一祖先。
种内同源基因（平行基因）：同一种生物内部的同
源基因，常是多基因家族的不同成员。
一般认为氨基酸的一致性或相似性在25%以上可
视为同源基因。
基因组学
杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和
基因剔除
Mario R. Capecchi(马里奥-卡佩奇)
Oliver Smithies(史密斯)
Martin J. Evans(埃文斯)
2007年诺贝尔生理学或医学奖得主
基因组学
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基因剔除：用一段无关的DNA片段取代某一特定的 基因，使其失去功能的技术。
主要原理：在一段无关片段的两侧连接与带换基因
两侧相同的顺序，将这一构件导入目的细胞，由于
同源片段之间的重组，可以使无关片段取代靶基因
整合到染色体中。为了便于筛选,用于取代的外源 DNA中含有报告基因。 基因剔除是最简便的基因失活的方法，用于高等生 物基因功能的研究。
基因组学
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基因组学
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相似性与一致性
249 MFN-MAI PFGAGAYAQALNQQQAALMASVAQGG
232 I LTSL TLPFS AGAYAQALNQQQTTV I S - -T S GS 注: 红色为一致性氨基酸, 蓝色为可取代氨基酸, 白色为趋
第五章 基因组序列诠释
§5.1 寻找DNA 序列中的基因 §5.2 基因功能预测 §5.3 从基因组到细胞
基因组学
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§5 基因组序列解读 §5.1 寻找DNA序列中的基因 寻找DNA序列中的基因 方法一：通过序列筛查定位基因 方法二：对DNA序列进行实验分析
基因组学
反义RNA：由基因的负链编码,可与正义
RNA (sense RNA)或DNA 编码顺序结合。
利用反义RNA能够与特异靶RNA通过配
对碱基间氢键作用而互补配对,从而在基 因复制、转录和翻译3个不同水平上干扰
正常基因的表达。
基因组学
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§5 基因组序列解读
§5.2 基因功能预测
基因组学
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内含子归巢：在I类和II类的某些内含子当中含有
ORF，可编码具有核酸内切酶、逆转录酶和成熟酶活 性的蛋白质，这种蛋白质可以使内含子插入到一个新
位点，这个过程称为内含子归巢。
内含子归巢突变技术可用于缺少同源重组系统生物的
功能基因组研究。
基因组学
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原核生物基因组：无内含子，基因序列不重叠， 无基因内基因
对于原核生物简单的ORF扫描可以定位大多数基因
基因组学
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起始密码子与终止密码子
TGGCGGAAATCTCAAAATCAAGCGGAAGCAATGGAGGAGAGAAGTGGAG ATCAACGTCGTCGTGGCCGCCGATGCTGCCGGTGATCATGATGGCCATG GCGATCTTGGCGGTGTCCTTCAACGGCGCCGCCGCCCAGCCGCCGCCGG ACACCAACGTGCTGTGCGTCAGCAAGTGCGGGACGTGCCCCACGGTGTG CTCGTCGCCGCCGCCGCCGGCGTCGGGGAACTATAATCCGGTGCTGTCG CCACCGAAGGGCACCGGCAGCGGCAGCGTTGGTGGGTCGTCGTCGTCGC CTTCGGCGCCGTTGGCGAAGGGAGGGCAGCCAGGCGGCAGCAACTACTA CTACTTCTTCACCTCCGGCGGCAGCAGCCATGGCTGCGCGGCGGCGCTG CTCCTGCCGCCGCTTGTGTCCCTCGCCGTCGCCGCTCTGTCGCAGTGAT CGATCGATCGTGTCCAGTATGATCACAGTAGCTAGCTAGCTATAGCTAG TGGGTTAATTAGCTGCTTGTTTAATTTGCACCTATATATTTTTCTTTTG CTGATCCCGATCGAGTTGTTGATATTTCGTGAATTACTTACTTATTATT ACCTGTTTAATACGAAACATGCAGTTTAATTTTC
异氨基酸。
一致性氨基酸百分比为红色氨基酸所占的比例.
相似性氨基酸百分比为红色和蓝色氨基酸相加所占的比 例。
基因组学
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方法二：对DNA序列进行实验分析
任何基因都可以转录成RNA，这是实验确认基因 的依据。 Northern杂交可以确定DNA片段是否 含有表达顺序。 Northern杂交判断DNA片段是否含有表达顺序 的注意事项：
基因组学
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真核生物ORF扫描遇到的困难 •基因间大量非编码序列 •绝大多数基因内存在内含子且外显子的长度 一般少于100个密码子
基因组学
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真核生物基因的组成特征
1) 外显子的组成 • 密码子偏爱 • 5’和3’非翻译区(UTR)碱基比率, 水稻基因5’的 高GC比
基因组学
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转基因检测基因功能
基因组学
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其他基因功能研究方法
酵母双杂交 噬菌体外显
基因组学
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酵母双杂交（yeast two-hybridization）
原理：
其原理涉及转录因子与启动子之间的互作。
可变剪接
基因表达的组织专一性与时空性 基因表达的产物丰度
基因组学
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Norhnern杂交 确定表达顺序
Northern杂交不易检测到的基因怎么办？
拟Northern杂交：根据已知的DNA顺序设计引物
从mRNA群体中扩增基因产物，再用DNA做探针 与扩增产物杂交。
种，基因编码区相似性高，非编码区同源性低，
因此将Baidu Nhomakorabea一物种的DNA顺序与来自另一亲缘种的
DNA片段杂交，如果产生阳性信号，则该区段可
能含有基因。
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动物园杂交（Zoo blotting)
基因组学
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正常条件下：
转录因子 （包括两个功能区域）→ 结合功能
域同基因上游的区段结合 → 激活功能域激活
RNA多聚酶 → 将基因转录为mRNA
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酵母杂交系统中：
融合表达载体1
DNA结合功能域 +目的片段 表达载体共转化 融合表达载体1 融合表达载体2
融合表达载体2
D ）模拟多肽高级结构相似
孤独基因：缺少同源顺序的ORF。
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同源查询（DNA顺序）
同源查询（氨基酸顺序）
基因组学
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同源性、一致性和相似性
1) 同源性基因系指起源于同一祖先但顺序已经发生变异的 基因成员, 分布在不同物种间的同源基因又称直系基因。 同一物种的同源基因则称水平基因。 基因同源性只有“是”和“非”的区别, 无所谓百分比。 2) 一致性系指同源DNA顺序的同一碱基位置的相同的碱基 成员, 或者蛋白质的同一氨基酸位置的相同的氨基酸成 员, 可用百分比表示。 3) 相似性系指同源蛋白质的氨基酸顺序中一致性氨基酸和 可取代氨基酸所占的比例。可取代氨基酸系指具有相 同性质如极性氨基酸或非极性氨基酸的成员, 它们之间 的代换不影响蛋白质(或酶)的生物学功能。
激活功能域+ 多种未知cDNA
同一细胞
形成聚合物，启动 报告基因的表达
干扰cDNA筛选的因素
cDNA丰度低（解决办法：cDNA文库分群、cDNA均 一化） mRNA二级结构（解决办法：高温反转录）
基因组学
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§5 基因组序列解读
§5.2 基因功能预测
基因功能预测：
计算机预 测基因功能
实验确认基因功能
1）基因失活 2）基因过表达
tk 胸苷激酶标记基因 ← gangcyclovir
neor 新霉素抗性基因→G418
基因组学
杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和
转座子突变库构建
转座子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过 切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置 “跳跃”到另一个位置。 1) 利用天然的DNA转座子构建表达载体转化受体细胞, 当转座子活化时可被动转座并随机插入受体细胞基因 组引起基因突变。 2) 将转化的发生转座事件的细胞系再生获得可遗传的 转化子后代, 观测突变再生植株的表型变化, 分离与克 隆插入突变基因的结构与功能。 3) 采用转座子突变技术可重复地大规模诱导和筛选插 入突变株系, 进行全基因组范围的基因功能研究。
基因组学
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密码子偏爱
基因组学
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同源查询
依据：现有生物不同种属之间具有结构或功能相似的 直系基因成员，序列保守。 同源有如下几种情况： A） DNA序列某些片段完全相同； B ）开放读码框（ORF）排列类似，如有长外显子； C） 开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性；
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§5 基因组序列解读 §5.1 寻找DNA序列中的基因 通过序列筛查定位基因 依据： 1) 基因的组成特点 2) 密码子偏爱 3) 同源查询
基因组学
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1) 基因的组成特点
起始密码子：ATG 终止密码子：TAA、TAG、TGA GC% = 50% 终止密码子每 64 bp出现一次； GC% > 50% 终止密码子每100－200 bp 出现一次； 由于多数基因 ORF 均多于50个密码子，因此最可能的 选择应该是 ORF 不少于100 个密码子。
构建反义RNA 表达载体:
将全目的基因或部分目的基因反向插入表达载体 → 转化目标生物 →获得转基因个体或品系 → 分 析转基因植株在生理、生化、形态等方面的变异 → 判别目的基因的功能
基因组学
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反义RNA 作用机理：
A 干扰翻译的起始与延伸，可与翻译起始顺序及编码序
§5 基因组序列解读
§5.1 寻找DNA序列中的基因
A 构建cDNA文库，用目的基因DNA片 段筛选文库。
B 根据已知片段设计引物，RACE 技术
得到基因的全长cDNA序列。
基因组学
杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和
DNA顺序中基因位置的确定
cDNA测序
cDNA与基因编码区对应，包含5’引导顺序和3’结尾顺 序。cDNA与基因组比较可以确定基因所在位置，还可 以找到外显子-内含子边界。
• 不含或含有较少的终止密码
2) 内含子的组成 • 内含子具有前体mRNA加工的特征顺序. • 内含子含有高比例的三种读框的终止密码.
基因组学
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真核生物内含子的出现给计算机判读基因带来了不少 问题，在编写ORF扫描程序时要作出修改加入一些相 应的规则: Codon bias（密码子偏爱）： 是指对于一个特殊 的物种来说，编码蛋白的密码子的使用频率并非都是 相同的。 Exon-intron boundaries（外显子-内含子边界） ： 供体位 5’-AG GTAAGT-3’ 受体位 5’-PyPyPyPyPyPyCAG-3’ Upstream control sequences（上游控制序列） 另外个别生物的基因组特有组成也可作为判别依据， 如脊椎动物基因组许多基因的上游都有CpG岛
列结合形成双链RNA，随之被细胞降解。
B 与mRNA 的引导顺序结合，阻止核糖体的附着，使翻
译无法启动。 C 反义RNA与mRNA形成双链分子后，使RNA多聚酶脱 离模板,转录终止。
基因组学
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基因超表达
通过增加基因的拷贝数和采用强启动子促 使基因超表达,致使受体表现出生长与发育 的异常,来研究基因的功能。
基因组学
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计算机预测基因功能
种间同源基因（直系基因）：不同物种之间的同源
基因，来自物种分隔之前的同一祖先。
种内同源基因（平行基因）：同一种生物内部的同
源基因，常是多基因家族的不同成员。
一般认为氨基酸的一致性或相似性在25%以上可
视为同源基因。
基因组学
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基因剔除
Mario R. Capecchi(马里奥-卡佩奇)
Oliver Smithies(史密斯)
Martin J. Evans(埃文斯)
2007年诺贝尔生理学或医学奖得主
基因组学
杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和
基因剔除：用一段无关的DNA片段取代某一特定的 基因，使其失去功能的技术。
主要原理：在一段无关片段的两侧连接与带换基因
两侧相同的顺序，将这一构件导入目的细胞，由于
同源片段之间的重组，可以使无关片段取代靶基因
整合到染色体中。为了便于筛选,用于取代的外源 DNA中含有报告基因。 基因剔除是最简便的基因失活的方法，用于高等生 物基因功能的研究。
基因组学
杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和
基因组学
杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和
相似性与一致性
249 MFN-MAI PFGAGAYAQALNQQQAALMASVAQGG
232 I LTSL TLPFS AGAYAQALNQQQTTV I S - -T S GS 注: 红色为一致性氨基酸, 蓝色为可取代氨基酸, 白色为趋
第五章 基因组序列诠释
§5.1 寻找DNA 序列中的基因 §5.2 基因功能预测 §5.3 从基因组到细胞
基因组学
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§5 基因组序列解读 §5.1 寻找DNA序列中的基因 寻找DNA序列中的基因 方法一：通过序列筛查定位基因 方法二：对DNA序列进行实验分析
基因组学
反义RNA：由基因的负链编码,可与正义
RNA (sense RNA)或DNA 编码顺序结合。
利用反义RNA能够与特异靶RNA通过配
对碱基间氢键作用而互补配对,从而在基 因复制、转录和翻译3个不同水平上干扰
正常基因的表达。
基因组学
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§5 基因组序列解读
§5.2 基因功能预测
基因组学
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内含子归巢：在I类和II类的某些内含子当中含有
ORF，可编码具有核酸内切酶、逆转录酶和成熟酶活 性的蛋白质，这种蛋白质可以使内含子插入到一个新
位点，这个过程称为内含子归巢。
内含子归巢突变技术可用于缺少同源重组系统生物的
功能基因组研究。
基因组学
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原核生物基因组：无内含子，基因序列不重叠， 无基因内基因
对于原核生物简单的ORF扫描可以定位大多数基因
基因组学
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起始密码子与终止密码子
TGGCGGAAATCTCAAAATCAAGCGGAAGCAATGGAGGAGAGAAGTGGAG ATCAACGTCGTCGTGGCCGCCGATGCTGCCGGTGATCATGATGGCCATG GCGATCTTGGCGGTGTCCTTCAACGGCGCCGCCGCCCAGCCGCCGCCGG ACACCAACGTGCTGTGCGTCAGCAAGTGCGGGACGTGCCCCACGGTGTG CTCGTCGCCGCCGCCGCCGGCGTCGGGGAACTATAATCCGGTGCTGTCG CCACCGAAGGGCACCGGCAGCGGCAGCGTTGGTGGGTCGTCGTCGTCGC CTTCGGCGCCGTTGGCGAAGGGAGGGCAGCCAGGCGGCAGCAACTACTA CTACTTCTTCACCTCCGGCGGCAGCAGCCATGGCTGCGCGGCGGCGCTG CTCCTGCCGCCGCTTGTGTCCCTCGCCGTCGCCGCTCTGTCGCAGTGAT CGATCGATCGTGTCCAGTATGATCACAGTAGCTAGCTAGCTATAGCTAG TGGGTTAATTAGCTGCTTGTTTAATTTGCACCTATATATTTTTCTTTTG CTGATCCCGATCGAGTTGTTGATATTTCGTGAATTACTTACTTATTATT ACCTGTTTAATACGAAACATGCAGTTTAATTTTC
异氨基酸。
一致性氨基酸百分比为红色氨基酸所占的比例.
相似性氨基酸百分比为红色和蓝色氨基酸相加所占的比 例。
基因组学
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方法二：对DNA序列进行实验分析
任何基因都可以转录成RNA，这是实验确认基因 的依据。 Northern杂交可以确定DNA片段是否 含有表达顺序。 Northern杂交判断DNA片段是否含有表达顺序 的注意事项：
基因组学
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真核生物ORF扫描遇到的困难 •基因间大量非编码序列 •绝大多数基因内存在内含子且外显子的长度 一般少于100个密码子
基因组学
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真核生物基因的组成特征
1) 外显子的组成 • 密码子偏爱 • 5’和3’非翻译区(UTR)碱基比率, 水稻基因5’的 高GC比
基因组学
杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和
转基因检测基因功能
基因组学
杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和
其他基因功能研究方法
酵母双杂交 噬菌体外显
基因组学
杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和
酵母双杂交（yeast two-hybridization）
原理：
其原理涉及转录因子与启动子之间的互作。
可变剪接
基因表达的组织专一性与时空性 基因表达的产物丰度
基因组学
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Norhnern杂交 确定表达顺序
Northern杂交不易检测到的基因怎么办？
拟Northern杂交：根据已知的DNA顺序设计引物
从mRNA群体中扩增基因产物，再用DNA做探针 与扩增产物杂交。