细菌原生质体融合步骤

细菌原生质体融合实验步骤

一、实验目的

了解原生质体融合技术的原理。

学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。

二、实验原理

原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径，但有些微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的限制。1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。由于它具有许多特殊优点，所以，目前已为国内外微生物育种工作所广泛研究和应用。

(一)、原生质体融合的优点

(1)、克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。

(2)、基因重组频率高，重组类型多。原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。原生质体融合后，两个亲株的整套基因组(包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。

(3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。

(4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。

(二)、原生质体融合步骤

(1)、选择亲本选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。

(2)、制备原生质体经溶菌酶除去细胞壁，释放出原生质体，并置高渗液中维持其稳定。

(3)、促融合聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。聚乙二醇为一种表面活性剂，能强制性的促进原生质体融合。在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时，更能促进融合。

(4)、原生质体再生原生质体已失去细胞壁，虽有生物活性，但在普通培养基上不生长，必须涂布在再生培养基上，使之再生。

(5)、检出融合子利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。

(6)、融合子筛选产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛选出生产性能良好的融合子。

(三)、原生质体再生率和融合率计算

三、实验材料

(一)、菌种：

枯草芽孢杆菌T4412 ade- his-、枯草芽孢杆菌TT2 ade-pro-

(二)、培养基(配制方法见下一页附录)：

(1)、完全培养基(CM，液体)；

(2)、完全培养基(CM，固体) 液体培养基中加入2.0%琼脂；

(3)、基本培养基(MM)；

(4)、补充基本培养基(SM) 在基本培养基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的纯化琼脂，75 Pa 灭菌20min；

(5)、再生补充基本培养基(SMR) 在补充基本培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖，1.0％纯化琼脂作上层平板，2.0％纯化琼脂作底层平板、75 Pa 灭菌20 min。

(6)、酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用)。

(三)、缓冲液：

(1)、0.1mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。

(2)、高渗缓冲液：于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。

(四)、原生质体稳定液(SMM)：

0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1 、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。

(五)、促融合剂：

40％聚乙二醇(PEG-4000)的SMM 溶液。

(六)、溶菌酶液：

酶粉酶活为4000 u/g，用SMM 溶液配制，终浓度为2 mg/mL，过滤除菌备用。(七)、器皿：

养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、吸管、显微镜、台式离心机、721 比色计、细菌过滤器。

四、实验步骤

(一)、原生质体的制备：

1、培养枯草芽孢杆菌：

取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。

2、收集细胞：

各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM 中，每mL 约含108～109 活菌为宜。

3、总菌数测定：

各取菌液0.5 mL，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36℃培养24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌数。

4、脱壁：

二株亲本菌株各取5 mL 菌悬液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为100 ug/mL，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。

5、剩余菌数测定：

取0.5 mL 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL，涂布于完全培养基平板上，36℃培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。

计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数

(二)、原生质体再生：

用双层培养法，先倒再生补充基本固体培养基(SMR)作底层，取0.5 mL 原生质体悬液，用SMM作适当稀释，取10-3、10-4、10-5 稀释液各1mL，加入底层平板培养基的中央，再倒入上层再生补充半固体培养基混匀，36℃培养48 h。分别计算二亲株的原生质体的再生率，并计算其平均数。

(三)、原生质体融合：

取两个亲本的原生质体悬液各1 mL 混合，放置5 min 后，2500 r/min 离心10 min，弃上清液。于沉淀中加入0.2 mL SMM 溶液混匀，再加入1.8 mL PEG 溶液，轻轻摇匀，置36℃水浴保温处理2 min，2500 r/min 离心10 min，收集菌体，将沉淀充分悬浮于2 mL SMM