高效凝胶色谱法测定头孢呋辛酯及制剂中高分子杂质的含量

高效凝胶色谱法测定头孢呋辛酯及制剂中高分子杂质的含量侯玉荣1，2，袁耀佐2*，张玫2，钱文2，杭太俊1*（1．中国药科大学，南京210008；2．江苏省食品药品检验所，南京210008）摘要目的：采用聚苯乙烯高效凝胶色谱法检查头孢呋辛酯中的高分子杂质。

方法：色谱柱为MKF－GPC－100聚苯乙烯凝胶色谱柱（7.8mmˑ100mm，8μm），流动相为水－甲醇（10ʒ90），流速为0.5mL·min－1，检测波长为278nm；通过HPLC－ESI－MS2法鉴定高分子杂质峰，并对其结构进行推定。

结果：头孢呋辛酯在0.5 1500μg·mL－1的浓度范围内，面积与浓度呈良好的线性关系（r=1.000）；最小检出浓度为0.2μg·mL－1；高分子杂质与头孢呋辛酯峰能有效分离，并先于主峰流出，方法专属性良好；高分子杂质在溶液中不稳定，样品需要临用现配。

结论：建立的方法快速准确，适用于酯溶性头孢呋辛酯及其制剂中高分子杂质的测定。

关键词：高效凝胶色谱；聚苯乙烯凝胶；头孢呋辛酯；高分子杂质；β－内酰胺类抗生素；过敏原中图分类号：R917文献标识码：A文章编号：0254－1793（2012）02－0267－06Determination of high molecular mass impurities in cefuroxime axetil and it's preparation by polystyrene－based gel filtration chromatographyHOU Yu－rong1，2，YUAN Yao－zuo2*，ZHANG Mei2，QIAN Wen2，HANG Tai－jun1*（1.China Pharmaceutical University，Nanjing210008，China；2.Jiangsu Institute for Food and Drug Control，Nanjing210008，China）Abstract Objective：To determinate the high molecular mass impurities in cefuroxime axetil by polystyrene－based gel filtration chromatography．Method：A MKF－GPC－100（7.8mmˑ100mm，8μm）column was adopt with the mobile phase consisting of water－methanol（10ʒ90），at a flow rate of0.5mL·min－1，and the detection wavelength was at278nm，to identify the impurities by HPLC－ESI－MS2．Result：The calibration curves for cefu-roxime axetil in the range of0.5－1500μg·mL－1was linear（r=1.000），the detection limit was0.2μg·mL－1；the peaks before cefuroxime axetil in the chromatogram were high molecular mass impurities，the resolution between cefuroxime axetil and high molecular mass impurities was good．The high molecular mass impurities is instable in so-lution，and the test solution should be prepared immediately before use．Conclusion：The established method is fast for analysis and good for precision，it's suitable for determinate the high molecular mass impurities in liposoluble drug cefuroxime axetil and it's preparation．Key words：HPSEC；polystyrene gel；cefuroxime axetil；high molecular mass impurities；beta－lactam antibiotics；al-lergenβ－内酰胺类抗生素常见的不良反应是速发型过敏反应，多年来的研究已证明引发过敏反应的过敏原不是抗生素本身，而是其中的高分子杂质［1，2］。

药品中的高分子杂质是对其中相对分子质量大于药物本身的杂质总称，其来源通常被分为2类，即外源性杂质（来源于发酵工艺的蛋白、多肽、多糖等结合物）和内源性杂质（抗生素药物自身的聚合产物，可以在生产、储存过程中形成，也可以在使用时产生）。

随着现代生产工艺不断的改进和提高，外源性杂质日趋减少，而对内源性杂质的控制是当前抗生素高分子杂质控制的重点［3，4］。

统计数据证明药品中高分子杂质的含量直接影响过敏反应发生率［5］，因此国内外对β－内酰胺类抗生素的高分子杂质的控制非常重视。

美国药典（USP）23版曾对头孢他啶中的高分子杂质进行控制，由于β－内酰胺类抗生素的高分*通讯作者袁耀佐Tel：（025）86631609；E－mail：yuanyaozuo@yahoo．com．cn 杭太俊Tel：（025）83271090；E－mail：tj_hang@yahoo．com．cn子杂质非常不稳定，制备和标化杂质对照品非常困难，无法供应杂质对照品而从药典中取消；英国药典（BP2009）采用RP－HPLC对阿莫西林、氨苄西林、头孢噻肟钠等品种中高分子杂质进行控制，用相对保留时间定位，用主成分自身对照法测定二聚体和三聚体的含量，成功地解决了杂质对照品无法提供的问题。

采用HPLC法测定药物中的高分子聚合物方便、快速，但实践证明，方法的开发难度很大，主要问题还是由于制备杂质对照品困难，无法定位色谱流出峰中哪些杂质是高分子杂质。

因此到目前为止，国内外开发成功的品种很少，除前面提及的品种外，还有艾他培南［6］、头孢地尼［7］、青霉素等［8］。

在β－内酰胺类抗生素的高分子杂质的控制问题上，我国属领先水平，金少鸿等［9 12］从70年代就开始对β－内酰胺类抗生素的高分子杂质的化学结构和生物学特性进行系统的研究，发现结构不同的高分子杂质通常有相似的生物学特性，均为过敏性杂质。

因此，在药品质量控制中，只需控制高分子杂质的总量。

经过大量的实验，成功地建立了根据相对分子质量差异进行分离的凝胶色谱分离模式，解决了RP－HPLC分离模式中无法确认高分子杂质的难题。

该方法用Sephadex G10为色谱柱填料，色谱柱可以手工装填，也有商品化色谱柱，简便、易行，根据β－内酰胺类抗生素在水溶液中具有缔合现象的特点，采用主成分自身对照法测定含量，解决了杂质对照品无法提供的难题，为β－内酰胺类抗生素的高分子杂质控制的常规化提供了可能。

中国药典从2000年版开始对头孢他啶等4个品种及相关制剂8个标准进行控制［13］，2005年版中国药典增加了7个品种13个标准的高分子杂质控制，2010年版中国药典已增加至22个品种43个标准的控制［14 16］。

由于Sephadex G－10属亲水性凝胶，对酯溶性β－内酰胺抗生素（如头孢呋辛酯，头孢泊肟酯等）无法测定，而HPLC法的建立也非易事，因此，脂溶性β－内酰胺类抗生素的高分子杂质的研究极少。

日本药典（JP）对难溶性的盐酸头孢卡品酯中的聚合物进行控制［17］，色谱柱为苯乙烯－二乙烯基苯共聚物为基质的TSK Gel G2000HHR疏水凝胶，色谱柱昂贵、不耐用，并且使用有许多限制，如不耐压、不能接触水等，测试成本很高，在我国不易推广。

为了研究脂溶性β－内酰胺类抗生素的高分子杂质，作者在盐酸头孢卡品酯分析方法的启发下，采用国产的苯乙烯－二乙烯基苯共聚物基质的、以分子量排阻为主要分离机制的色谱柱填料，建立了高效凝胶色谱系统，用于测定头孢呋辛酯（图1）中的高分子杂质的检查，通过LC－ESI－IT－MS2法，对方法的专属性进行了确认。

即该色谱系统中先于头孢呋辛酯的流出峰为高分子杂质的峰，通过一级和二级质谱信息，对其可能产生的聚合物结构进行了推定。

图1头孢呋辛酯结构式Fig1Chemical structure of cefuroxime axetil1药品和试剂Waters2695－2996液相色谱仪（美国Waters公司）；TSQ Quantum Ul－tra AM型LC－PDA－MS/ MS联用仪，Xcalibur1.1数据处理系统（美国Ther-mo－Finnigan公司）。

头孢呋辛酯对照品由中国食品药品检定研究院提供，头孢呋辛酯原料、头孢呋辛酯片由国内多个生产企业提供，批号222906005A，20091001，20091002，20091003等；头孢呋辛酯进口片由葛兰素史克药业有限公司提供，批号0347838；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为去离子水。

2色谱条件及质谱条件2.1HPLC凝胶色谱条件聚苯乙烯凝胶色谱柱MKF－GPC－100（7.8mmˑ100mm，8μm）；水－甲醇（10ʒ90）流动相；流速0.5mL·min－1；柱温35ħ；检测波长278nm；进样体积20μL。

2.2质谱条件电喷雾正离子化电离（ESI），喷雾电压4.5kV，雾化气压325kPa，辅助气压力110 kPa，毛细管温度350ħ。

总离子扫描（TIC）和二级质谱扫描检测CID，能量25eV。

3色谱条件的选择与优化3.1流动相组成的选择取头孢呋辛酯对照品适量，精密称定，用流动相溶解稀释制成1mg·mL－1的溶液，在25ħ放置12h，精密量取20μL，分别用表1中的4种流动相进行分析，色谱图如图2所示，用头孢呋辛酯主成分与其高分子杂质峰之间的分离度、杂质检出个数及总分析时间为分析指标，发现上述4种色谱系统中，水－甲醇（10ʒ90）作为流动相时，各项指标最优，故选用水－甲醇作为流动相（图2），进行色谱条件优化。

表1用于优化色谱分离的不同流动相组成Tab1The mobile phase for optimizating the chromatographic system编号（code）流动相（mobile phase）杂质个数（impuritiesnumber）分离度（杂质1和2；杂质2和主成分）［resolution（impurity1and2；impurity2and main peak）］峰高（杂质1，2）［peak height（impurity1，2）］分析时间（assay time）/mina水－乙腈［water－acetonitrile（10ʒ90）］1－－－b水（甲酸调至pH3.0）－甲醇［water（pH3.0with formic acid）－methanol（10ʒ90）］2 5.9；1.289816；1005620 c水－甲醇［water－methanol（10ʒ90）］2 6.2；1.7104251；1588020d pH7.0的0.05mol·L－1磷酸盐缓冲液－甲醇0.05mol·L－1［0.05mol·L－1phosphate buffer solution（pH7.0）－methanol（10ʒ90）］2 1.9；1.126546；1401610图2不同流动相系统下头孢呋辛酯与高分子杂质分离的色谱图Fig2Chromatograms from the system solution in different mobile phase a d．同表1（same as Tab1）3.2流速的影响在水－甲醇（10ʒ90）色谱系统中，考察选流速对色谱分离的影响。