阿尔茨海默病大鼠自噬相关蛋白Beclin—1和凋亡相关蛋白p53表达变化及电针的调控作用

阿尔茨海默病大鼠自噬相关蛋白Beclin—1和凋亡相关蛋白p53表达
变化及电针的调控作用
目的观察电针对大鼠海马自噬相关蛋白Beclin-1和凋亡相关蛋白p53表达的影响，探讨电针治疗阿尔茨海默病（AD）的作用机制。

方法将大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和电针组。

电针组取“百会”和“涌泉”进行电针治疗，每日1次，7 d为1个疗程，共治疗4个疗程。

疗程结束后尼氏染色观察各组海马CA1区组织形态的变化并计数尼氏体阳性细胞，Western blot检测Beclin-1和p53蛋白的表达。

结果模型组CA1区尼氏体阳性的细胞数目较正常组显著减少（P＜0.01），电针组锥体细胞和尼氏体表达较模型组明显增多（P＜0.05）。

与正常组比较，模型组海马组织中Beclin-1蛋白表达降低、p53蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，电针组Beclin-1蛋白表达明显升高（P＜0.01），p53蛋白表达降低（P＜0.05）。

结论电针治疗可对抗β-淀粉样蛋白诱导的神经元凋亡，改善AD海马组织形态变化。

标签：电针；阿尔茨海默病；凋亡；自噬；Beclin-1蛋白；p53蛋白；大鼠
上海中医药大学名师传承研究工程项目（2009120）
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种慢性进行性的中枢神经系统退行性变性病，β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）沉积形成的老年斑、神经原纤维缠结和神经元及其突触的缺失是其典型特征。

目前AD的临床药物只能对症治疗，无法逆转其病理进程。

自噬是细胞长寿命蛋白、变性或衰老细胞器的主要降解途径[1]。

研究表明，自噬功能障碍与多种错折叠蛋白聚集体导致的神经变性疾病有关[2-3]。

自噬障碍可能影响Aβ的清除和增加神经细胞死亡[4]，表明自噬可以保护神经元免受Aβ诱导的凋亡[5]，与AD的病理生理学密切相关。

针灸治疗AD具有诸多的优势，且疗效明确[6-7]。

本研究在构建AD大鼠模型的基础上，通过检测自噬相关蛋白Beclin-1和凋亡相关蛋白p53的表达变化，探讨电针治疗AD的作用机制。

1 实验材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠60只，体质量（200±50）g，上海中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（沪）2008-0016，实验室符合国家动物实验设施屏障系统标准。

1.2 主要试剂与仪器
Aβ1-40，美国Sigma公司；Beclin-1兔抗大鼠多克隆抗体和HRP标记山羊抗兔二抗，美国cell signaling technology公司；p53山羊抗大鼠多克隆抗体，美
国Santa Cruz公司；HRP标记驴抗山羊二抗，美国Jackson ImmunoResearch公司；尼氏染色液和BCA蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司。

针灸针，吴江市云龙医疗器械有限公司；立体定位仪（江湾I型），第二军医大学生理教研室研制；电泳仪和转膜仪，美国Bio-Rad公司。

2 实验方法
2.1 造模
将Aβ1-40溶于生理盐水，再用PBS稀释成终浓度5 μg/μL，37 ℃孵育1周，使其变为聚集状态[8]。

腹腔注射10%水合氯醛麻醉SD大鼠，将其头部固定于脑立体定位仪上，剪毛后常规皮肤消毒，沿正中矢状线纵行切开皮肤，暴露前囟，参考大鼠脑立体定位图谱[9]，以前囟为原点，向后3.5 mm，左、右旁开2.0 mm 为注射点，用牙科钻钻开左右对称的2个小孔，自脑颅骨表面进针深度为3.0 mm，用微量进样器抽取2 μL Aβ1-40，每点缓慢注射1 μL，5 min内注射完毕，注射完毕后留针5 min，使Aβ1-40扩散至注射部位，缓慢拔针后缝合皮肤。

为防止感染，术后连续3 d肌肉注射青霉素8万单位。

假手术组注射等量人工脑脊液。

2.2 分组与治疗
模型建立后7 d开始进行电针治疗。

大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和电针组，每组6只。

电针组取“百会”和“涌泉”，用0.25 mm×13 mm无菌毫针，“百会”平刺约2.5 mm，“涌泉”直刺约1.5 mm，连接G6805A型电针治疗仪，选择连续波，频率为20 Hz，强度以肢体局部轻微抖动且大鼠能安静耐受为度。

针刺治疗每日1次，每次30 min，7 d为1个疗程，疗程间休息1 d，治疗4个疗程。

正常组、假手术组及模型组正常饲养，不予电针治疗。

2.3 尼氏染色
Morris水迷宫检测结束后，部分动物经10% 水合氯醛腹腔注射麻醉，打开胸腔，充分暴露心脏，将注射针头插入左心室，随即剪开右心耳，快速灌注100 mL预冷的0.9%氯化钠溶液将血管内血液冲洗干净，然后缓慢灌注250 mL预冷的4%多聚甲醛至大鼠四肢强直、全身变硬后，快速断头取脑。

将脑组织置于4%多聚甲醛中后固定24 h，然后进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋。

以注射点为中心做5 μm厚冠状切片，所有切片均包含海马区。

取各组切片，二甲苯脱蜡、水化后，滴加尼氏染色液，室温染色10 min，分别经脱水、透明后用中性树胶封片，显微镜下观察各组海马CA1区尼氏体的表达。

每只动物随即选取5个视野进行细胞计数。

2.4 Beclin-1和p53蛋白表达测定
采用Western blot方法测定。

各组大鼠颈椎脱臼处死取脑，冰上分离海马组织，加入含苯甲酰磺酰氟的RIPA裂解液，玻璃匀浆器冰上匀浆后离心，收集总蛋白，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各标本蛋白浓度。

每个标本各取30 μg
上样后进行SDS-PAGE凝胶电泳。

在半干转印仪上转膜40 min将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h。

倾去封闭液后，分别与Beclin-1、p53、GAPDH 一抗和HRP标记二抗孵育。

磷酸盐吐温缓冲液洗膜3次后，滴加增强化学发光化学发光试剂反应1 min，将膜固定于片夹内，暗室压片，显影定影。

扫描胶片后，通过ImageJ图像分析软件计算目的蛋白的表达量，用目的蛋白的净像素值与GAPDH的净像素值的比值表示。

3 统计学方法
采用SPSS15.0统计软件进行分析。

实验数据均用—x±s表示，组间比较采用方差分析。

P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果
4.1 电针对大鼠海马CA1区形态学的影响
尼氏染色观察可见，正常组和假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞层次丰富，排列紧密整齐，尼氏体染色较深；与正常组比较，模型组海马CA1区锥体细胞排列稀疏杂乱，细胞缺失，尼氏体表达明显减弱，甚至消失；电针治疗后，海马组织形态明显好转，锥体细胞和尼氏体表达显著增多，但仍未达到正常组和假手术组的水平。

与正常组比较，模型组CA1区尼氏体阳性的细胞数目明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，电针组CA1区尼氏体阳性的细胞数目明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。

）
4.2 电针对大鼠海马组织Beclin-1、p53蛋白表达的影响
图1 各组大鼠海马组织Beclin-1和p53蛋白表达
5 讨论
AD是引起老年痴呆最常见的原因。

这种神经退行性疾病典型地以渐进性记忆衰减开始，并且最终不可逆地发展为全面认知功能障碍。

海马是人类大脑处理学习和记忆的关键区域。

神经元有规则的排列是海马和齿状回皮层构造最突出的特征。

海马的主神经元包括锥体细胞和颗粒细胞，它们密集排布呈显著的带状，构成海马非常明显的界限。

不同的形态结构是器官组织执行各种生理功能的物质基础。

随着AD病理进程的发展，海马神经元逐渐丧失，从而引起记忆和认知功能衰退的临床症状[10]。

本研究显示，正常组大鼠海马CA1区锥体细胞排列紧密整齐，尼氏体染色较深，模型组海马CA1区锥体细胞排列稀疏杂乱，大量神经元缺失，尼氏体表达明显减弱，甚至消失。

电针治疗可明显改善海马组织形态结构。

与模型组比较，电针组CA1区尼氏体阳性细胞的数目较模型组显著增多。

结果提示，电针可保护海马区神经元抵抗Aβ造成的细胞丢失，从而保持海马区正常的神经元排布特征，改善和提高学习记忆和认知功能。

研究表明，AD等神经退行性疾病与自噬功能障碍密切相关。

自噬可通过降
解长寿命蛋白、蛋白聚合物以及损伤细胞器调控细胞的稳态。

自噬的过程包括一系列有序的步骤，包括核化、延长、包裹、降解等程序，其降解产物氨基酸可被机体重新利用。

Beclin-1是自噬相关的特异性基因，直接参与自噬体的形成，在自噬体形成的核化阶段发挥调控作用[11]。

在转基因小鼠AD模型中，Beclin-1杂合缺失降低神经细胞的自噬，可以增加9月龄小鼠神经细胞内Aβ的积聚和沉积，并促进神经变性[2]。

自噬调节或Aβ-α7nAChR运输系统的障碍可能影响Aβ的清除和增加神经细胞死亡[4]。

本研究表明，Aβ注射可使海马组织Beclin-1表达减少，而电针能提高Beclin-1水平，通过调控自噬活性，减少神经元丢失，改善受损组织形态结构。

p53为肿瘤抑制基因，编码一种分子量为53 kDa的蛋白质p53，在控制细胞周期、细胞凋亡、基因组稳定性、抑制血管新生等方面扮演重要角色。

p53调控凋亡的作用已受到广泛重视。

p53主要通过线粒体途径介导细胞的凋亡。

它通过转录活化多种靶基因，如p21、Bax、Bcl-2等调节细胞周期或细胞凋亡。

p53表达水平在AD动物模型和AD患者脑中明显升高[12]，这与海马神经元的凋亡有直接的关系。

本研究发现，电针治疗可明显降低海马组织p53的表达水平。

这与以前的报道结果一致[13]。

我们发现，电针可以调节Bax和Bcl-2的平衡比值和凋亡执行蛋白Caspase-3的表达，对抗Aβ诱导的神经元凋亡[7]。

本研究进一步提出，电针可能通过调控p53途径，介导其下游蛋白Bax、Bcl-2等的表达，发挥抗凋亡作用。

虽然凋亡和自噬在形态学和生化代谢途径方面都有显著的区别，但二者在功能上却存在一定的联系。

自噬是一把双刃剑，一般来说，自噬通常先于凋亡，在病理环境早期，自噬可保护细胞免于发生凋亡，而随着过度自噬的发生，自噬又可向凋亡转化，最终导致细胞死亡。

在Aβ毒性下，出现大量自噬体的神经元并未见凋亡现象，通过3-甲基腺嘌呤抑制自噬可能导致神经元凋亡。

这些结果表明自噬可以保护神经元免受Aβ诱导的凋亡[5]。

p53不仅与细胞凋亡有关，而且还参与了自噬的调控[14]。

Beclin-1可影响泛素特异性肽酶USP10和USP13的去泛素化活性，从而对p53蛋白水平进行调控[15]。

本研究结果也提示，电针可能通过上调自噬活性，减少p53介导的神经元凋亡。

综上所述，电针治疗可通过上调海马组织中自噬相关蛋白Beclin-1的水平，介导促凋亡相关蛋白p53的表达，对抗Aβ诱导的神经元凋亡，减少神经元的丢失，改善海马组织的形态变化。

本研究为推广电针治疗AD及阐明电针治疗AD 作用机制提供了实验依据。

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