DNA分子标记技术在物种鉴定和系统分析中的应用

DNA分子标记技术在物种鉴定和系统分析中的应用

刘派

(北京科技大学化学与生物工程学院生物技术系，北京市100083) 摘要：随机扩增多态DNA(randomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)，是美国学者Williams和Welsh于1990年首先提出的该技术是通过分析DNA的PCR产物的多态性来推测生物体内基因排布与外在性状表现的规律的技术。RAPD技术是以8-lObp的随机寡核苷酸片段作为引物，对基因组进行PCR扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或PAGE电泳检测后显色，分析扩增产物DNA片段的多态性，此即反应了基因组相应片段由于碱基发生缺失、插入、突变、重排等所引发的DNA多态性。至今，该技术已广泛应用于种质资源研究，作物遗传多样性分析，基因定位，找特定基因，如抗性基因、雄性不育恢复基因等可连锁的标记和物种识别，植物系统进化研究等多个领域，本文以草坪草为实验对象进行RAPD标记技术的应用。

关键词：RAPD分子标记；凝胶电泳；草坪草；随机扩增；DNA

引言

RAPD技术一方面继承了PCR率高、特异性强、样品用量少以及检测容易等特点。此外，与其它DNA多态性分析方法相比。RAPD技术还表现出很多独特的优势和特点:（1）不必知道被测DNA特异性位点序列信息；（2）模扳DNA的量极少；（3）RAPD技术操作简便快速；（4）RAPD所用引物均为人工定序合成；（5）基因型的检测自动化。本实验在液氮环境下提取六种植物的DNA后，用实验室编号为131-136的引物对六种DNA进行随机扩增，接下来对其进行TBE凝胶电泳实验操作，得到跑胶结果并对其进行分析。

1RAPD标记原理

1.1原理

ＲＡＰＤ技术利用一系列随机引物，以ＤＮＡ为模板，通过基因放大器进行多态性ＤＮＡ片段的随机合成．如果某一引物与某一片段的模板ＤＮＡ具有互补的核苷酸顺序．该引物就会结合到单链的模板ＤＮＡ上，在具有４种游离ｄＮＴＰｓ的情况下．通过ＤＮＡ聚合酶连接．ＤＮＡ链就会从引物的３’－ＯＨ端开始，某一引物可能会与单链ＤＮＡ的许多地方结合．但只有在２０００个碱基对以内．存在反向平行的某一引物互补的双链ＤＮＡ分子，才可能将合成的新链作为下一次合成的模板．这个反应由３个不同温度的反应步骤连续循环所组成．第一步．欲扩增ＤＮＡ双链的变性．ＤＮＡ双链在９２－９４℃加热变成单链，快速冷却阻碍了单链ＤＮＡ的重新结合．第二步，退火，随机寡核苷酸引物互补地靠在ＤＮＡ模板链的目标位置上．退火温度通常在３５－３９℃．对于理想的ＲＡＰＤ技术条件按经验必须优化．第三步．适温延伸，共进行３５－４５次循环．扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，经ＥＢ染色来检测扩增片段的多态性．ＲＡＰＤ所用的一系列引物其序列各不相同．但对于任一特定的引物．它同基因组ＤＮＡ有特定的结合位点．如果这些结合位点在基因组某些区域内的分布符合ＰＣＲ扩增的条件，就可扩增出ＤＮＡ片段．因此．如果基因组在这些区域内发生ＤＮＡ片段插入、缺失、或碱基突变就可能导致这些特定位点分布发生相应的变化．而使PRC产物增加、缺少或发生分子量的改变．因此通过对ＰＣＲ产物的检测即可测出基因组ＤＮＡ在这些区域的多态性．由于进行ＲＡＰＤ分析时可用引物数量很大．虽然对每个而言其检测基因组ＤＮＡ多态性的区域是有限的．但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组．因此ＲＡＰＤ可以对整个基因组ＤＮＡ进行多态性检测．

1.2 RAPD技术的优点

ＲＡＰＤ技术一方面继承了PRC效率高、特异性强、样品用量少以及检测容易等特点．此外．与其它ＤＮＡ多态性分析方法相比．RAPD技术还表现出很多独特的优势和特点：第一，由于RAPD技

术引物的设计是随机的，因此．可在不知道特异性位点序列信息的情况下，对各种生物进行ＤＮＡ多态性分析．构建其基因指纹图谱；第二，ＲＡＰＤ技术需模扳ＤＮＡ的量极少．每个反应仅需几十纳克ＤＮＡ；第三，ＲＡＰＤ技术操作简便快速．可免去其它ＤＮＡ标记中的克隆制备，多态性筛选，同位素标记等步骤；第四，ＲＡＰＤ所用引物均为人工定序合成；第五，每个ＲＡＰＤ标记就相当于一个序列位点，故这种方法可以使基因型的检测自动化。

1.3 影响RAPD的因素

引物的合成是随机的，但要满足G+C 的含量不低于40%，引物的长度以10bp 为佳，引物太短(<9bp)易从模板上脱落，聚合反应难以进行;引物的浓度通常是0.2umol/L，这一浓度足以完成40 个循环的扩增反应，引物浓度过高可能导致错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，这两者均可竞争酶、dNTP和引物。但如引物浓度不足，则PCR 的效率极低，扩增产物的产量太低。

4 种dNTPs在使用时必须以等当量浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。

2 实验步骤

2.1 实验材料准备

一. 配制1 M Tris-HCl (pH8.0)

配方:

1 M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)

(1). 称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中。

(2). 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

(3).

pH值。

(4).

(5). 高温高压灭菌后，室温保存。

二. 配EDTA（0.5 mol/l pH8.0）

配方:

EDTA（0.5 mol/l pH8.0）

(1)称取93.06克EDTA•2Na•2H2O，置于500 mL烧杯中

(2)加入约400 mL dd H2O.用热磁力搅拌器充分搅拌

(3)用NaOH调节pH值到8，约用10克固体NaOH

(4)在溶液冷却后，再用NaOH调节至pH=8

(5)加dd H2O将溶液定容到500 ml

(6)高温高压灭菌后，室温保存

三. 1×TE Buffer 储存液

分装至500mL锥形瓶中，250mL/瓶，分成4瓶。灭菌备用。

配方

组份浓度10 mMTris-HCl，1 mM EDTA（pH8.0）

(1). 量取下列溶液，置于1L烧杯中。

1 M Tris-HCl Buffer（pH8.0）10mL

0.5mol/L EDTA（pH8.0）2mL

(2). 向烧杯中加入约800mL的去离子水，均匀混合。

(3). 将溶液定容至1L。

(4). 高温高压灭菌，室温保存。

将三种的溶液配好后，再统一灭菌，保存。

四. 准备灭菌水（500 mL蓝盖瓶装）1瓶，黄枪头，蓝枪头，白枪头，进口1.5 mL离心管2盒，普通1.5 mL离心管2盒，普通4 mL离心管2盒，PCR小指管200 μl 2盒，灭菌，保存。

五. 电泳缓冲液：

5×TBE（贮存液/L室温保存）

54 g Tris碱

27.5 g硼酸

20ml 0.5mol/L EDTA（pH 8.0）

0.5×TBE（工作液）

2.2草坪草基因组DNA的提取

草坪草提前两至三周种植，当草坪草的生长到了比较茂盛的阶段，即可进行基因组DNA的提取。使用天根新型植物基因组提取试剂盒(DP320)，操作步骤如下：

1. 处理材料：清洗研钵及研磨棒，晾干或烘干，液氮预冷。取草坪草新鲜叶子组织100 mg 加入液氮充分研磨。加入400 μl缓冲液LP1和6 μ

l RNase A（10 mg/ml），漩涡震荡1 min，室温放置10 min。

2. 加入130 μl缓冲液LP2，充分混匀，漩涡震荡1 min。

3. 12000 rpm（~13400 g）离心5min，将上清移至新的离心管中。

4. 加入1.5倍体积的缓冲液LP3（使用前检查是否已加入无水乙醇），立即充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀。

5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一