实验三 酵母核糖核酸(RNA)的提取[1]

思考题
• 1.核酸的溶解性质是什么?常用什么试剂
分离沉淀核酸?
• 2.为什么用酵母作为实验原料？如何使
RNA从酵母中释放出来？
• 3.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行?
实验五 RNA的定量测 定——紫外(UV)吸收法
一、目的要求
1. 掌握紫外线（UV）吸收法测定核酸浓 度的原理。 2. 熟悉紫外分光光度计的使用方法。
• 10. 10％抗坏血酸(Vc)溶液： 10g抗坏血酸溶于 100ml水。贮棕色瓶中。溶液呈淡黄色尚可用， 如呈深黄色即失效。
• 11．二苯胺试剂： 称取1.5g二苯胺（如不纯， 须在70％乙醇中重结晶2次），溶于100ml冰醋酸 （AR）中，再加入浓H2SO41.5ml， 摇匀，贮在 棕色瓶中放冰箱内保存备用。 • 12．沉淀剂(钼酸铵—过氯酸试剂)：0.25％钼酸 铵溶于2.5％过氯酸中。如配200ml，即在 193ml 水中加入7m170％过氯酸和0.5g钼酸铵。
管号 测定管 对照管 RNA水解液 5％H2SO4 0.2ml 不加 不加 0.2ml 浓氨水 5滴使成碱性 5滴使成碱性 50g／L AgNO3 5滴 5滴
注：加浓氨水使呈碱性可用pH 试纸检定。 加入AgNO3后，观察有何变化。静置15分钟后，再比较两管中之沉 淀。
2.磷酸的鉴定：取试管两只，分别标明测 定管与对照管，然后依次加入下列各试剂：
四、操作步骤
• 1.核酸的提取：每二人用大试管取1g干酵母, 加入0.05mol NaOH溶液5ml提取，放入试管沸 水浴加热30分钟，并经常搅拌。 • 待冷却后加入乙酸5～8滴，使提取液呈酸性 (石蕊试纸)，移在离心管里，离心10分钟 (3500转／分)。 • 将上清液倒入另一离心管中，加入95％乙醇 2ml，边加边搅。加毕，离心10分钟，即可得 到核酸钠的白色沉淀。
计算程序 ①加人H2O2 ml 数 ②加人H2O2mmol=①×标定浓度 ③底物浓度［S］=②÷4
0.004 ④酶作用后，KMnO4滴定ml
1 0.50
2 1.00
3 1.50
4 2.00
5 2.50
⑤剩余H2O2mmol=④×0.005×5/2
实验七 维生素C的定量测定 2.6- DCPIP（2.6-二氯酚靛酚）滴定法
• 3．反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形瓶5只， 编号，按下表操作。
加入物(ml) 1 2 3 4 5
H2O2(约0.08mol/L)
蒸馏水
0.50
3.0
1.00
2.50
1.50
2.00
2.00
1.50
2.50
1.00
将各瓶置37℃水浴预热5min，依次加入1：1000稀释血液每瓶 0.5ml，边加边摇，继续保温准5min，按顺序向各瓶加 25%H2SO4 2.0ml，边加边摇，使酶促反应立即终止。 最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至微红色,记录KMnO4消耗量 (ml)。
四、操作步骤
1.准确称取松针约1g。样品必须用温水洗去泥土，并在空气中 风干。放入研钵中，加1g石英砂，再加酸化蒸馏水5～10ml 一起研磨。 2. 离心（3500转/分）10分钟，将上清液移入容量瓶，用酸化 蒸馏水定容至50ml。 3.取10ml上述溶液放入小锥形瓶内，用微量滴定管，以2，6– DCPIP（蓝色）滴定至提取液呈现淡粉红色，并保持15～30 秒不褪。(滴定过程必须迅速，不要超过2min。因为在本滴 定条件下，一些非维生素C还原物质的还原作用较迟缓，快 速滴定右以避免或减少它们的影响) 4.另取10ml酸化蒸馏水作空白对照滴定。 • 提取液和空白对照各做三份，对结果取平均值进行计算
• 2.核酸的水解：在含有核酸钠的离心管 中加入5％硫酸2ml，用玻棒搅匀，沸水 浴煮10分钟。 • 其中1ml水解液放进EP管里，贴好标签冷 冻保存（下次试验用）
3.核酸的鉴定
取水解液，按下表所列程序分别鉴定
核酸的嘌呤碱、磷酸及核糖和脱氧核糖。
1.嘌呤碱的鉴定：取试管两只，分别标明测定管 与对照管，依次加入下列各试剂。
（三）RNA的化学组成的鉴定
• （1）嘌呤碱鉴定：与硝酸银作用产生白色 的嘌呤银化合物沉淀。 • （2）核糖的鉴定：地衣酚（3,5—二羟甲 苯试剂）显色法 • （3）磷酸的鉴定：与钼酸铵试剂作用产生 黄色的磷钼酸铵沉淀[(NH4)3PO4· 12MoO3↓]。 • （4）脱氧核糖的鉴定：与二苯胺试剂反应 生成蓝灰色沉淀，如没有沉淀产生，说明 没有DNA.
二、实验原理
• 核酸及其衍生物，核苷 酸、核苷、嘌呤和嘧啶有 吸收UV的性质，其吸收高 峰在260nm波长处。测得 未知浓度核酸溶液的
A260nm值，即可以计算出
其中RNA或DNA的含量。该 法操作简便，迅速，并对 被测样品无损，用量也少。
三、试剂
• 钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取3.6ml 70%过氯酸和 0.25g钼酸铵溶于96.4ml蒸馏水中，即成0.25%
钼酸铵－2.5%过氯酸溶液。
四、操作步骤
• （1）取0.5ml未知浓度的RNA溶液（上次实验提 取），用蒸馏水稀释至50ml，此为A液。 • （2）取A液2ml，再稀释至50ml，为B液。 • （3）另取4ml A液，加1ml沉淀剂，摇匀后置冰水 中20分钟，离心（3500rpm/min，10分钟），取上 清液2.5ml，稀释至50ml，此为C液。 • 沉淀剂的作用是，使RNA沉淀析出，得到不含RNA 的对照液。 • （4）分别取B，C液于厚度为1cm的石英比色杯， 在260nm波长处测定A值。
计算
A260 RNA或DNA浓度＝ N 1000 0.024(或0.020) L
式中△A260为B管稀释液在260nm波长处A值减去C管稀释 液在260nm波长处A值。N为稀释倍数.
0.024（或0.020）表示1mg/ml RNA（或DNA）溶液测定的
A260值相当于0.024。此为多次试验验证的数值。
管号 测定管 对照管 RNA水解液 5％H2SO4 0.2ml 不加 不加 0.2ml 钼酸铵试剂 5滴 5滴 VC 5滴 5滴
放置数分钟，观察两管颜色有何不同。 磷酸+钼酸铵——磷钼酸+Vc——钼蓝
3.核糖的鉴定：取试管两只，分别标明测定管与
对照管，然后依次加入下列各试剂。
管 号 RNA水解液 5％H2SO4 3，5-二羟甲苯
三、试剂
1. 干酵母粉。
2．0.04mol氢氧化钠溶液。
4．95％乙醇。
3．乙酸。
5．5％硫酸。
6. 浓氨水。
7. 50g/L硝酸银溶液。
• 8．地衣酚（3,5—二羟甲苯试剂）：取比重 1.19HCl 100ml，加入FeCl3· 20 100mg及二羟甲 6H 苯100mg，混匀溶解后，置于棕色瓶中，此试剂必 须在临用前新鲜配制。市售的3,5—二羟甲苯不能 使用，必须用苯纯化结晶l～2次，并用活性炭脱 色方可使用。 • 9．定磷试剂：2.5％钼酸铵溶液：20ml水溶解2.5 克钼酸铵，加5mol／L H2S0430ml，用水稀释至 l00ml，此试剂可在冷处保存一月不变质。
三、试剂
1．0.05mol/L草酸钠标准液 将草酸钠（AR）于100～105℃烘 12h。冷却后，准确称取0.67g，用水溶解倒入100ml量瓶中， 加入浓H2SO4 5ml，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数 周。 2．约0.02ml KMnO4储存液 称取KMnO4 3.5g，溶于1000ml蒸馏 水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点 温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保 存。 3．0.004mol/L KMnO4应用液 取0.05mol/L草酸钠标准液20ml， 于锥形瓶中，加浓H2SO4 4ml，于70℃水浴中用KMnO4贮存液滴 定至微红色，根据滴定结果算出KMnO4贮存液的标准浓度，稀 释成0.004mol/L，每次稀释都必须重新标定储存液。 4．约0.08mol/L H2O2液 取20%H2O2（AR）40ml于1000.0ml量瓶 中，加蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/L KMnO4标定之，稀 释至所需浓度。 5．0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）。
五、计算
1．反应瓶中H2O2浓度(mol/L) H2O2 mol浓度 加入H2O2ml数
4
（式中：4为反应液量4ml） 2．反应速度的计算：以反应消耗的H2O2 mmol数表示。 反应速度=加入的H2O2 mmol数－剩余的H2O2 mmol数 剩余的H2O2 mmol数：KMnO4 0.005 mol/L×消耗的KMnO4毫升数× 5/2 （式中：5/2为KMnO4与H2O2反应中mol换算系数） 3．求Km值：实验测得的结果，以1/v对1/[S]作图，求出V和Km的数值。
实验三 酵母菌RNA的提取、鉴定及
定量测定
来自百度文库
一、实验目的
•
掌握稀碱（NaOH）法分离酵母RNA的原理与方 法
• 了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。
二、实验原理
• （一）目前常用的RNA的制备方法 • 浓盐法：是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁
的通透性，使核酸从细胞内释放出来。成本低、适于大规模
测定管
4滴
不加
6滴
对照管
不加
4滴
6滴
将两试管放入沸水浴内加热10分钟，比较两管之颜色。
4.脱氧核糖的鉴定：取两试管分别标明测定管与
对照管，然后依次加入下列各试剂。
管 测定管 对照管 号 RNA水解液 4滴 不加 5％H2SO4 不加 4滴 二苯胺 6滴 6滴
将两试管同时放入沸水浴内，加热10分钟后，比较两 管之颜色。
思考题
• 1.核酸的溶解性质是什么?常用什么试剂
分离沉淀核酸?
• 2.为什么用酵母作为实验原料？如何使
RNA从酵母中释放出来？
• 3.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行?
实验六 过氧化氢酶米氏常数（Km） 的测定
一、实验目的
•
学习米氏常数的测定方法。
二、实验原理
米氏常数的测定
米氏常数的测定：双倒数作图法（Lineweaver1 Km 1 1 Burk法） — = —— . — + ——
• （2）2，4-二硝基苯肼法 • （3）碘酸法 • （4）碘量法 • （5）荧光分光光度法 （总VC）
三、试剂及仪器
（一）试剂及材料 （1）松针 （2）酸化蒸馏水 （3）2，6–DCPIP；将50mg 2，6–DCPIP溶解于约200ml含有52mg 碳酸氢钠的热水中。冷后稀释至250ml。装入棕色瓶内。放在 冰箱里保存。2，6–DCPIP不稳定, 每周必须重新配制，使用前 需按照下法标定： 取5ml标准抗坏血酸溶液加5ml 1％草酸，以2，6–DCPIP滴定 呈粉红色，并在15秒钟内不退色为终点。计算2，6–DCPIP溶液 的浓度。 （4）标准抗坏血酸溶液：溶解100mg纯抗坏血酸粉状结晶于1％ 草酸中，然后稀释到500ml。 使用前临时配制。 （二）器材 （1）锥形瓶（50ml）（2）小研钵（3）吸量管（10ml）（4）漏 斗（5）滤纸（6）容量瓶（50ml）（7）微量滴定管（5ml）
四、操作步骤
• l．血液稀释： 吸取新鲜（或肝素抗凝） 血液0.1ml，用蒸馏水稀释至10ml，混匀。取 此稀释血液1.0ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0， 0.2mol/L)稀释至10ml，得1：1000稀释血液。 • 2．H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，加 浓度约为0.08mol/L的H2O2 2.0ml和25%H2SO4 2.0ml，分别用0.004mol/L KMnO4滴定至微红 色。从滴定用去KMnO4 ml数，求出H2O2的 mol 浓度。
v Vmax [S] Vmax
二、实验原理
• 本实验测定红细胞中过氧化氢酶的米氏常数。过氧化氢酶 (CAT)催化下列反应：
• 2H2O2
•
CAT
2H2O+O2↑
H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。
• 2KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4 ----- 2MnSO4＋K2SO4＋5O2↑＋8H2O • 求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度。作图求出过 氧化氢酶的米氏常数。
操作。 • 稀碱法: 是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用
酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA。提 取的RNA有不同程度的降解。稀碱法的提取时间短，提取率
高于浓盐法，更利于工业化生产。
（二）实验材料的选择 • 酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA， 含量为干菌体的2.67%-10.0%，而DNA含量 较少，仅为0.03%-0.516%。为此提取RNA 多以酵母为原料。
一、实验目的
• 1. 学习并掌握定量测量维生素C的原 理和方法。 • 2. 熟练微量滴定法的基本操作。
二、实验原理
• 维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，根据它具有的还 原性质可以测定维生素C的含量。常用的测定方法有
• （1）2，6-DCPIP (Dichlorophenolindo phenol ) （还原型VC）