高通量筛选法对苦瓜中降血糖活性成分的研究

第14卷第4期天津农学院学报V ol.14, No.4 2007年12月 Journal of Tianjin Agricultural University December, 2007 文章编号：1008-5394（2007）04-0029-04

高通量筛选法对苦瓜中降血糖活性成分的研究*

何新益1，2，刘仲华2，刘金福1

（1. 天津农学院食品科学系，天津 300384；2. 湖南农业大学天然产物研究中心，长沙 410128）

摘要：利用PPAR高通量筛选法研究了苦瓜中具有降血糖作用的活性成分。以SMMC-7721肝癌

细胞为模型细胞，经MTS实验，确定了苦瓜提取物的适宜浓度为50 mg/L，并以此浓度对PPARα、

PPARγ、PPARδ3受体的激活能力进行了研究。结果发现：苦瓜水提物MC3对PPARδ和PPARγ受

体有激活作用，激活倍数分别达到1.966和1.698，是苦瓜中潜在的具有降血糖作用的活性成分。

关键词：PPAR；高通量筛选；苦瓜；糖尿病

中图分类号：TS201.2；R965.1 文献标识码：A

Studies on Anti-diabetic Active Ingredient of Momordica charantia L.

by HTS

HE Xin-yi1，2，LIU Zhong-hua2，LIU Jin-fu1

（1. Department of Food Science，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；2. Center of R&D of Natural Products，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

Abstract: Anti-diabetic active ingredient of Momordica Charantia L. was studied by PPAR high throughput screening. The SMMC-7721 liver cancer cells were employed as model cells. For all samples，the best concentration of extracts was 50 mg/L. And the activity ability of PPARα，PPARδ，PPARγ agonists of Momordica Charantia L. extracts was studied using the concentration. Results show that MC3 can activate the agonist of PPARδ or PPARγ. And the activities were 1.966 and 1.698 times respectively. MC3 could be a potential anti-diabetic ingredient.

Key words：PPAR；high throughput screen；Momordica charantia L.；diabetes mellitus

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是一种因体内胰岛素绝对或相对分泌不足而引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱的慢性全身性疾病，与遗传因素以及多种环境因素相关。DM的各种并发症已经成为DM 患者致残和早亡的主要原因。近20 a来，DM发病率迅速上升，逐渐成为全球流行的慢性非传染性疾病。其中，又以Ⅱ型DM急剧增加为主，已占糖尿病患者总数的90%以上。Ⅱ型DM发病机制复杂，经典的抗Ⅱ型DM的药物存在多种缺陷，如可导致患者出现低血糖、轻度乃至中度贫血、水肿、肥胖、心衰等不良反应，无法满足患者的需求。从天然产物中寻求更好的降糖活性成分已成为一种新趋势。苦瓜（Momordica charantia L．）是著名的民间中草药，药理实验的结果表明苦瓜具有显著的降血糖作用[1-3]。苦瓜降血糖活性成分及其作用机理是近年研究的热点之一。有研究报道，Ⅱ型糖尿病与过氧化物酶增殖激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）存在密切的关系[4-5]。本试验选用以PPARα、δ、γ三种亚型为作用靶点的高通量筛选（high throughput screen，HTS）模型，从苦瓜中寻找具有降血糖作用的有效成分，为开发新型的、天然的降糖活性保健品和药物提供理论依据。

1 材料与方法

*

收稿日期：2007-07-24

作者简介：何新益（1974-），男，湖南郴州人，博士，副教授，主要从事农产品加工与贮藏方面的教学与科研工作。联系电话：（022）23782596，E-mail：hedevid@。

天津农学院学报第14卷·30·

1.1 材料和主要仪器

长白和青皮2个苦瓜品种取自湖南农业大学蔬菜试验基地。5-氟尿嘧啶、二甲基亚砜、匹尼尼酸、2-溴十六烷酸、罗格列酮为Sigma公司产品；PBS和DPBS为Hyclone公司产品；PMS和MTS为Promaga 公司产品；FuGENE6为Roche公司产品；其它试剂均为国产分析纯。

肝癌细胞系SMMC-7721细胞株，质粒7721-PPARα、PPARγ、PPARδ均由深圳微芯公司提供。1.2 方法

1.2.1 苦瓜提取物的制备

苦瓜果盐溶蛋白粉（MC1）的制备：苦瓜果经低温干燥、去杂后加入0.05 mol/L磷酸缓冲液低温浸提。浸提条件为：pH 7.5，0～4 ℃，固液比为1∶10，24 h浸提2次。浸提液离心，合并上清液后加入3倍体积的丙酮进行沉淀。沉淀物低温透析过夜，浓缩透析液，冷冻干燥，得苦瓜果盐溶蛋白丙酮粉。

苦瓜醇提物（MC2）：苦瓜果经低温干燥、去杂后粉碎，加入10倍体积的80%乙醇，室温下浸提3 h，浸提2次，分别离心后合并上清液，上清液浓缩去乙醇，干燥得醇提物。

粗多糖（MC3）的制备：热水浸提苦瓜醇提物的残渣。浸提条件为：75 ℃，2 h/次，固液比为1∶10，浸提2次，离心后合并上清液，浓缩至1/5体积，加入3倍体积95%乙醇进行沉淀，离心后向沉淀物中依次加入95%乙醇和无水乙醇洗涤，冷冻干燥即为苦瓜粗多糖。

苦瓜籽盐溶蛋白粉（MC4、MC5）的制备：将2个品种的苦瓜籽去壳，石油醚（60～90 ℃）脱脂后，加入0.05 mol/L磷酸缓冲液低温浸提。浸提条件为：pH 7.5，0～4 ℃，固液比为1∶10，24 h内浸提2次。浸提液离心后合并上清液，上清液中加入3倍体积的丙酮进行沉淀，沉淀物低温透析过夜，浓缩透析液，冷冻干燥，得长白苦瓜籽盐溶蛋白丙酮粉（MC4）和青皮苦瓜籽盐溶蛋白丙酮粉（MC5）。

1.2.2 样品筛选浓度的确定

采用四氮唑盐酶还原法（MTS）确定筛选浓度。具体步骤如下：（1）准备一瓶底面积为75 cm2的、已铺满80%瓶底，生长状态好且处于对数生长期的肿瘤细胞SMMC-7721。弃去细胞瓶中的培养基，用5～6 mL 磷酸缓冲液洗涤细胞1次，弃去磷酸缓冲液，加入约4 mL的消化液于37 ℃的细胞培养箱中消化。在显微镜下仔细观察细胞。当发现细胞间距变大、胞体变圆时立即中止消化，弃去消化液，加入5 mL培养液，并对瓶底细胞进行适度吹打，以使细胞从瓶底脱落下来。吹打均匀后取适量细胞液，用血球计数板计数细胞的总浓度。根据细胞计数结果取一定量的细胞液至加样槽中，用培养液进行适度稀释，调节细胞浓度（贴壁细胞的终浓度一般为5×104个/mL，悬浮细胞的终浓度一般为2×105个/mL）后进行试验。（2）用12道移液器对96孔细胞培养板进行加液，每孔加入细胞液100 µL。加液完毕后，将其置于37 ℃、5% CO2的孵箱中培养过夜以使细胞贴壁。（3）待各孔细胞贴壁后（约孵育24 h左右），将板取出。弃去板中培养液后，每孔再补加190 µL的新鲜培养液。分别加入10 µL阴性对照液、阳性药溶液（5-氟尿嘧啶）以及10 mg/L和50 mg/L 2种初筛质量浓度不同的受试药物溶液（药物皆采用DMSO 为溶剂进行配制）。再将96孔板置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养，隔夜后于显微镜下观察各孔中药物对细胞的作用。（4）药物作用48 h后取出96孔板，将孔中培养液吸出，加入60 µL培养液与MTS、PMS 的混合液，2 h后取出，在酶标仪上于490 nm下测定其吸光值。（5）受试样孔吸光值减去空白孔的吸光值后，以溶剂对照组的吸光值为100%，采用细胞活性等于OD490 nm（药物）/OD490 nm（溶剂对照）的方法，计算出药液浓度不同时细胞吸光值的相应百分比，得到药物作用48 h后细胞的存活率；根据存活率确定进一步试验的筛选浓度。细胞存活率计算如下式。

细胞存活率＝OD490 nm（药物）

OD490 nm（溶剂对照）

1.2.3 高通量药物的筛选

转染前一天，将生长良好的细胞接种至96孔板，使其密度在转染时达40%～80%。将转染剂FuGENE6从-20 ℃的冰箱中取出，在室温下平衡10～15 min。依据转染总量各取出1个0.2、0.5或1.5