流式细胞仪原理讲解

90 Degree Scatter
Forward Scatter Projection
Neutrophils
光路-荧光信号
• 每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激 发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即 是它特定的发射波长.
• 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检 测)这些光学信号
荧光染料的特性
基本原理
流路
• 流动室
• •
鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml
光路
• • • 光源 检测信号 光电倍增管PMT HV
电路
• 放大电路HV及GAIN 增益
•
A/D转换
•
统计：计算机
流
• 单细胞悬液
路
• 大多数仪器是在50-300 µm 大小的孔径中, 将细胞悬液注射进入鞘液中 • 这一过程,成为流体动力学聚焦
流式细胞仪
• 工作原理 • EPICS XL/MCL
• FC500MCL/MPL
流式细胞术的原理
• 流式细胞术（FCM）是一 种能对单个细胞、分子和 生物颗粒（微生物）进行 多参数快速检测的新型分 析和分选技术。近几年随 着多种单克隆抗体的成功 制备和多种荧光素的应用。 FCM逐步运用于对疾病诊 断和治疗监测的临床检验 常规工作。
FLOW CELL
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
光
光源
路
检测信号 散射光信号 FS: 前向角散射光 SS: 侧向角散射光(90度散射光) 荧光信号 荧光染料 光学滤片 颜色补偿 电路----光电倍增管
光 路
wavelength
减法颜色补偿
• 减法补偿
– 去除叠加信号,在使用双色以上时会产生减得过多的错误 – BD FACSCalibur – 补偿试剂
PE
PE
FITC
Correct
FITC FITC
• 光源 与通过的细胞聚焦在同一点上 • 激光 空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green, 空冷/水冷 Enterprise II 水冷 Innova300系列 Innova70系列
检测信号
散射光信号—前向散射光(FS)
• FS----Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光 检测器 • FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形 状及 optical homogeneity 有关 • FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如:大小
前向散射光
散射光信号 – 侧向散射光
• SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器 • SS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状 及 optical homogeneity 有关 • SS用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多少, 核质比
侧向散射光
Light Scatter Gating
Side Scatter Projection
1000
Forward Scatter
Scale
1000 200 50 40 20 15 8
200 400 600 800
100
30
Monocytes
Lymphocytes
0
0 200 400 600 800 1000
标准带通滤片 band pass
630/30 nm BP
光源
通过的光谱
615-645 nm light
Unique 4-Color Single Laser Design
620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5) 575BP FL2 (RD1)
525BP FL1 (FITC) Air-cooled Argon Ion Laser Side Scatter Detector 645DL 600DL 550DL 488BK 488DL Forward Scatter Detector
Parameter Histogram: Count vs MFI
Immunophenotyping
15
Count
11
7
3
0
0
0
0
0
.1
1
10
100
1000
Log FITC
颜色补偿
• 各荧光染料发射的荧光信号有重迭, 因 此要进行色补偿以除去重迭部分
￫
光谱重叠需进行色补偿
FLA FLB
emission intensity
绿色
橙色 橙红 红 橙红
PECy7
PerCP APC
488
488 633
755
67 - 滤片特性
• 当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过 一定波长的光,同时也可以阻断并折射该 波长以下的光
• 这种方式的滤片称为二向色性滤片 ( dichroic filter)
Absorbance filter Source light Certain colors absorbed Passed light
Beam Shaping Lenses High Sensitivity Quartz Flow Cell
Optics - Detectors
– Photomultiplier tube (PMT)
• 将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号
不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程
Single
Beam Shaping Lenses High Sensitivity Quartz Flow Cell
PC7
675BP(PC5) 575BP FL2 (RD1)
525BP FL1 (FITC) Air-cooled Argon Ion Laser Side Scatter Detector 700DL 600DL 550DL 488BK 488DL Forward Scatter Detector 750BP FL4 (PC7)
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色
FITC
PE(RD1) ECD PeCy5 PI
488
488 488 488 488
525
575 620 675 620
免疫荧光
免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光 DNA染色