免疫比浊法测C反应蛋白

免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。

抗体（Ab）与可溶性抗原（Ag）反应，形成一定结构的免疫复合物，成为悬浮于反应溶液中的微粒。在沉淀反应中形成的复合物微粒具有特殊的光学性质，可用仪器检测，提高了检测的速度、灵敏度和易操作性。

免疫比浊测定注意事项：

1、抗原或抗体量大大过剩，可出现可溶性复合物，造成误差。

2、应维持反应管中抗体蛋白始终过剩。

3、易受到脂血的影响。

分类

1.免疫透射比浊法抗原抗体结合后，形成免疫复合物，在一定时间内复合物聚合出现浊度。当光线通过溶液时，可被免疫复合物吸收。免疫复合物量越多，光线吸收越多。光线被吸收的量在一定范围内与免疫复合物的量成正比。利用比浊计测定光密度值，复合物的含量与光密度值成正比，同样当抗体量一定时，光密度值也与抗原含量成正比。本法较单向琼脂扩散试验和火箭电泳等一般免疫化学定量方法敏感、快速简便，但要求免疫复合物的数量和分子量达到一定高度，否则就难以测出。

2.免疫散射比浊法一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液使遇到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少密切相关。散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测抗原越多，形成的复合物也越多，散射光也越强。散射光的强度还与各种物理因素，如加入抗原或抗体的时间、光源的强弱和波长、测量角度等密切相关。散射比浊法又分为速率散射比浊法和终点散射比浊法。

3.免疫胶乳比浊法胶乳比浊法即是将待测物质相对应的抗体包被在直径为15－60nm的胶乳颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，光通过之后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而提高试验的敏感性。

实验八免疫比浊法测定C-反应蛋白

【原理】

血清C反应蛋白（CRP）与试剂中抗人CRP抗体结合，形成免疫复合物，一起吸光度增加，在波长340nm和700nm处测定免疫复合物浊度。根据吸光度增加

量，即可定量检测血清中CRP的含量。

【试剂】

1．0.1 mol/L的Tris缓冲液。

2．羊抗人CRP抗血清。

3．CRP定标液。

【操作步骤】见表8-1。

表8-1 免疫比浊法测定C反应蛋白操作步骤加入物空白管标准管测定管

血清标本(μl) －－15

CRP定标液(μl) －15 －

生理盐水(μl) 15 －－

缓冲液(μl) 350 350 350 混合，于37℃保温5 min，在波长340nm和700nm处

读各管吸光度(A1

340、A1

700

)

抗人CRP抗血清 (μ

l)

50 50 50

混合，于37℃保温5 min，在波长340nm和700nm处

读各管吸光度(A2

340、A2

700

)

【计算】

HDL-C含量 (mmol/L)＝×标准液浓度

⊿A＝(A2

340－A2

700

)－(A1

340

－A1

700

)

【参考范围】

血清C反应蛋白＜4mg/L(各实验室应有自己的参考范围)

【注意事项】

1．使用新鲜血清，并尽可能快地检测。

2．试剂不能冷冻保存。

【临床意义】

CRP是一种急性相蛋白，肝脏是其主要的合成器官。最近研究表明，人体其他部位如冠状动脉平滑肌细胞、神经元细胞、血管内皮细胞、脂肪细胞、肾小管上皮细胞等在炎症刺激或病理状态下都能合成和分泌CRP。正常情况下，CRP以微量存在于健康人的血清中，但在机体有细菌感染、组织损伤、肿瘤形成等急性相刺激时，CRP水平可升至正常的100倍甚至更高。测定CRP对于鉴别感染、监测疾病活动情况及严重程度、器质性疾病的筛检、监测器官移植受体排斥反应及疗效观察、冠心病等急性血管意外事件的预测与诊治等有很好的导向作用。【评价】

CRP的检测方法从灵敏度较低的免疫扩散法、火箭电泳法、胶乳凝集试验到高灵敏度、高精密度的放射免疫、酶免疫、免疫比浊等定量试验。多数情况下，

半定量的胶乳凝集试验适合于筛查，但其影响因素多、灵敏度较差和不能精确定量。对于需作较精确的CRP定量测定，免疫浊度法较为合适。其他方法如ELISA、免疫发光法和化学发光法虽然灵敏度和精确度都较高，但其成本也较高,故不是理想的临床实验室的常规方法。

1材料与方法

1.1兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳的制备

1.1.1兔抗人白蛋白抗体的制备采用25％人血浆白蛋白注射液，按常规免疫新西兰纯种白兔，获得兔抗人白蛋白免疫血清（效价1:32），经饱和硫酸铵沉淀后，过DE－52层析柱，IgG峰部洗脱液用Follin酚法于540nm处定量测定IgG 蛋白含量，并用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳鉴定，仅出现一条区带。

1.1.2兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳的制备取10％羧化聚苯乙烯胶乳悬液（军事医学科学院动物中心产品，Φ=0.6μm），用pH8.2甘氨酸缓冲液（GBS）稀释成1％浓度，将其于兔抗人白蛋白IgG按适当比例混合，以常规物理吸附法致敏胶乳[2]。

1.2敏感性试验

取25％人血浆白蛋白20μl，加入生理盐水180μl，再经系列稀释成10个浓度，其浓度范围在25mg/ml～3.125ng/ml之间，用兔抗人免疫羧化胶乳做3次重复检测。

1.3特异性试验

将牛、马、羊、豚鼠血清分别稀释至5％、2.5％和1.25％，用兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳检测。

1.4重复性试验

用四批兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳，对5份粪微量白蛋白阳性粪便标本和2份已知浓度白蛋白溶液平行检测，并在有效期内用同一批免疫羧化胶乳先后7次重复检测，同时设阴性对照。

3讨论

兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳试剂对粪微量白蛋白的检测，是针对粪便中由于病变部位出血后的血浆蛋白，或组织渗出液中的白蛋白。而检测粪微量白蛋白作为大肠肿瘤的筛检手段之一，最早是在1987年，日本中山拓郎等曾用ELISA