表面增强拉曼散射作用在免疫标记检测中的应用研究进展

表面增强拉曼散射作用在免疫标记检测中的应用研究进展

焦昆鹏

（河南科技大学食品与生物工程学院洛阳471023）

摘要：SERS标记免疫检测具有灵敏度高、高光谱选择性，特别适合分子识别、药物筛选、生物靶向等生物医药领域，和食品、环境检测领域。本文就SERS现象、SERS标记免疫检测的基本原理和SERS标记免疫检测的研究进展进行了简单的论述和总结。

关键词：SERS；免疫检测；研究进展

表面增强拉曼现象（SERS）自1974年被M. Fleischmann等首次报道以来，相关理论和应用研究一直是科学研究的热点。多数分子的SERS光谱和普通拉曼光谱差别较大，因此SERS光谱可用于研究分子-界面相互作用。由于水分子的拉曼截面很小，拉曼光谱适合于水环境的检测。同时，SERS具有极高的检测灵敏度，特殊条件下甚至可以达到单分子和单纳米粒子的检测。在生物技术领域，SERS金纳米标记方法结合免疫检测技术是一个研究热点。该方法将具有强拉曼信号的标记分子和抗体（抗原）蛋白分子吸附于纳米金表面，通过拉曼谱仪检测标记分子的SERS信号，以达到示踪抗原/抗体的目的。相比其他免疫检测方法，SERS标记免疫检测具有灵敏度高、高光谱选择性，特别适合分子识别、药物筛选、生物靶向等生物医药领域，和食品、环境检测领域。本文就SERS现象、SERS 标记免疫检测的基本原理和SERS标记免疫检测的研究进展进行了简单的论述和总结。

1.拉曼散射

1928年，印度物理学家Raman和Krishnan根据一些科学家在1923-1927年间的语言，首次在苯中发现了散射光频移的现象，即拉曼效应[1]。拉曼散射是由于物质对光的非弹性散射引起。当入射光子以一定的能量与某一分子发生非弹性碰撞后，光子频率出现位移，位移量与碰撞分子的某一振动频率相等。散射后的光子能量与入射光子相比，可能增高也可能降低，这取决于与之碰撞的分子是处于激发态还是基态。当光子与某一处于基态的分子相互作用后，光子激发某一振动失去能量，散射后光子表现出较低能量V s，这种散射称为斯托克斯散射；当

光子与处于某一振动激发态的分子相互作用后，获得能量表现出较高的能量V as，称为反斯托克斯散射[2]。

当激光的激发频率和分子中的电子转移发生共振时，对于一定的振动拉曼散射截面出现106的增加。这就是共振拉曼散射（RRS）。但并不是所有的分子都在所采用的激发光频率下都具有电子吸收。在非共振拉曼散射中，由于散射过程决定其散射截面的数量级为10-30cm2，比分子荧光低了14个数量级。这使得拉曼散射光谱自发现以来，由于拉曼散射截面小，检测灵敏度低而没有被广泛应用。

2.表面增强拉曼散射（SERS）的发现

1974年，M. Fleischmann在电化学粗糙的银电极表面发现了吡啶的拉曼信号[3]。起初人们以为拉曼信号是由电化学粗糙使得电极表面积增加引起。后来，Van Duyne和Jeanmaire得到吡啶在粗糙电极表面的信号比通过分子计算得到的信号强105-106倍[4]。Creighton等人随后也得到类似的结果[5]。种种证据表明这种表面上的强烈拉曼信号是由拉曼散射效率自身产生的。这种增强以后就被称为表面增强拉曼散射（Surface Enhanced Raman Scattering,SERS）。

SERS的发现给表面科学和光谱学领域带来的了极大的震撼。人们通过大量的实验和理论研究归纳了SERS的一下一些特点。

（1）SERS具有拉曼散射自身的一些优点。它能提供分子的微观结构信息，是一种对样品破坏极小的检测手段。与红外光谱相比它可以采用可见光、制样简单和水的拉曼散射非常弱等特点。

（2）SERS具有极高的表面灵敏度。吸附在金属表面的第一层分子可以获得最大的增强，同时它还具有长程增强作用，在离开金属表面数十埃乃至10纳米的距离内都有增强作用。

（3）在粗糙的贵金属Au、Ag、Cu表面可获得106的增强效应，其中以Ag 的增强效果最佳。在Li、Na、K、Al等自由电子金属表面也观察到较强的SERS 效应。

（4）拉曼跃迁的选律在SERS中被放宽，有时拉曼非活动的振动模式也会出现在SERS光谱中。

（5）作为一种表面技术它也存在一定的局限性。首先，我们起初只能在Au、Ag和Cu等贵金属表面观察到SERS，这严重地限制了SERS在其它金属表面的实际应用。其次，能产生较大的SERS增强的金属，其表面必须具有50-200nm 的粗糙度。在表面科学中经常出现的原子级平滑表面上观察不到SERS。

作为高灵敏的研究界面-分子的光谱手段，SERS的应用可以分为理论基础研究和检测应用两个方面。其中检测应用方面，因灵敏度高而广泛用于化学和化工成分分析、生物医学标记、生物传感器、食品检测等领域。

3. SERS标记免疫检测的原理

SERS标记免疫技术是在生物免疫应答的基础上发展起来的，主要基于类似三明治结构的构建，基底上的固相抗体通过与抗原的结合形成“固相抗体-待测抗原-标记抗体”夹心复合物，通过对标记分子SERS信号的识别进行免疫分析（图1）。

这种检测技术具有独特的优越性[6]：首先拉曼光谱峰宽度通常比其他光谱如荧光要窄10~100倍；其次拉曼散射受水的影响小；再次SERS信号很少受光腿

色的影响，所以可在一定程度上为获得较好的信号而适当地延长检测时间；另外SERS标记物不会发生自猝灭，可以通过增加标记抗体上的标记物数量来增强SERS信号，提高检测灵敏度。

4. SERS标记免疫检测的研究进展

目前，SERS标记免疫研究的热点主要集中在如何减少非特异性吸附与提高灵敏度两个方面。其中固相基地的制备与修饰以及抗体的标记是研究的关键。制备均一性良好的固相基地是SERS标记免疫检测的基础，采用合适的标记方法兼顾生物活性同样是提高检测性能的关键。目前国内外各研究小组均力求在此有所突破，以更好的提高检测灵敏度与减少非特异性吸附。

4.1检测灵敏度

免疫检测是一种很敏感的检测方法，亲和力及结合动力学是抗体抗原相互作用的强度特征。在建立一种免疫检测法时，抗体抗原的亲和力往往决定了检测的下限，即敏感性的大小。抗原抗体反应后直接测定形成的沉淀或浊度，敏感度可达5-10ug/ml[7]，但在有些情况下，某些待测物在标本中的含量远低于这一水平，因此要寻找增加敏感度的方法。

Ekins提出了一系列有关免疫分析灵敏度的富于指导性的观点[8-10]，影响免疫分析灵敏度的主要因素有：（1）抗体-抗原间免疫反应的亲和性，抗体-抗原间免疫反应的亲和性是影响免疫分析灵敏度的最根本的因素。采用高亲和性抗体是实现高灵敏度免疫分析的前提；（2）标记物的比活度（可检测性），采用高比活度的标记分子有利于提高免疫分析的信噪比，进而改善免疫分析灵敏度；（3）实验操作的精准性；（4）结合标记物与游离标记物分离的完全程度；（5）抗体-抗原免疫反应的特异性。

SERS作为一种免疫检测的新方法在近年来得到了很大的发展，它在标记免疫研究领域无疑也是一个理想的工具，特别体现在它的谱带窄，灵敏度高的特点上。通过采用具有表面增强效应的固相基底或标记颗粒进行SERS免疫检测充分发挥了SERS特殊的表面增强效应。同时采用较强SERS效应的标记分子，增强标记分子吸附量也有利于改善信号测量的精密性，从而提高免疫分析的灵敏度。