酵母原生质体融合

酵母原生质体融合
生态学院生物11 20号李香
酿酒酵母，又称面包酵母或出芽酵母。

酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，广
泛的用于制作面包和馒头等食品及酿酒，是发酵中最常用的生物种类。

酿酒酵母的细胞为
球形或者卵形，直径5–10μm。

其繁殖的方法为出芽生殖。

酵母菌种优劣直接影响发酵产品的价值，在自然界中菌种大多不具有较高的价值，因
而对菌种的选育和改良显得尤为重要。

原生质体融合是一项应用广泛的菌种改良技术。

原
生质体融合 (protoplast fusion)是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成
原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加入物理的或化学的或生物的助融条件，使双亲
株的原生质体间发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，进而发生基因组间的交换重
组，可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来。

从而获得带有双亲性状的、遗传性能
稳定的融合子(fusant)的过程[1]。

目前常用的融合方法有化学融合、生物融合、电融合以及激光诱导融合等。

本实验用酿酒酵母2.339与酿酒酵母2.70作为融合双亲，进行融合，旨在计算两种菌原生质体的形成率、再生率及融合率。

望能将融合后的原生质体应用于酿酒生产中以获得
较高的经济效益。

1材料
1.1样品
菌种：酿酒酵母(Saccharomgces cerevisiae)的两种营养缺陷型菌株(如met-、lys-)。

1.2 培养基和试剂
(1)马铃薯培养基：马铃薯(去皮) 200g，葡萄糖20g，水1000 mL。

配制方法下：将马铃薯
去皮，切成约2cm2的小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加糖，在补足水分1000 Ml,自然pH。

(2)YEPD培养基(用于酵母原生质体融合)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄20g蒸馏水1000 mL，pH6.0。

(3)YEPD高渗培养基(含0.6 mol/L NaCl的YEPD)：在YEPD培养基中0.6mol/L NaCl，3％
琼脂。

(4)YNB基本培养基：0.67%酵母氮碱基(YNB，不含氨基算，Difco)，2%葡萄糖，3％琼脂，pH6.2。

另一配方为：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 1g，K2HPO4 0.125g，(5)KHPO4 0.875g，KI 0.0001g，MgSO4•7H2O 0.5g，CaCl2•2H2O 0.1g，微量元素母液1mL，微生素母液1mL(母
液均按常规配制)，水1000 mL，pH5.8~6.0。

(6)YNB高渗基本培养基：在YNB基本培养基中加入0.6 mol/L NaCl。

(7)预处理液：EDTA-巯基乙醇液，由0.1 mol/L EDTA配制成0.4%巯基乙醇。

(8) 原生质融合助融剂：30％PEG6000、0.1 mol/L CaCl2、pH7.0。

(9) 去壁酶液：1%蜗牛酶、0.6 mol/L NH4Cl、50 mol/L DTT(二硫苏糖醇)，过滤除菌。

(10)生理盐水(0.85%NaCl)
(11) 0.6 mol/L NaCl
(三) 实验用具
试管、三角瓶、摇床、恒温培养箱、恒温水浴锅、离心机、接种环、移液管、酒精灯、分
光光度计。

2实验方法
2.1原生质体的制备
2.1.1收集菌体
从斜面上取两亲本菌株各一环酵母菌分别接种于5 mL含有YEPD液体培养基的试管中，30℃静置培养24 h后，取0.3~0.5 mL转接至装有50mL新鲜YEPD培养基的250 mL
三角瓶中，摇床30℃培养至对数早期(14～16h)，细胞数达107-108/mL。

离心(4000r/min，
10min)收集菌体。

2.1.2菌体的预处理
菌体用生理盐水洗两次(离心条件同前)，去上清液后，于离心管中加入预处理液(其用
量约为每克湿重菌体用4mL处理液)，30℃，30min，离心(1000 r/min)，10 min，取沉淀物。

2.1.3酶液处理去壁
于上述离心管中加入新鲜配制的酶液5~10 mL (酶液用量约为1%~2%)，轻轻摇动，悬
浮细胞，然后于30℃摇床轻轻振荡(100r/min)培养50~60min，每隔20min取样于相差显微
镜下观察，绘图并计数原生质体的形成率(按下列公式计算)。

待90%以上细胞都形成原生
质体后，离心(2000r/min，5min)去除酶液，并用0.6 mol/L NaCl洗涤两次(离心条件同上)，
用4 mL 0.6 mol/L NaCl将原生质体制成悬液，备用。

原生质体形成率=[原生质体数/(原生质体数+完整细胞数)]*100%
2.2原生质体的再生
将原生质体包埋于半固体琼脂中，并倾注于再生基本培养基上，这是双层培养法，可
大大提高原生质体再生率。

首先在培养皿中铺一底层含琼脂2.5％的高渗YEPD再生培养基，放温箱中烘数小时，使其表面脱水。

然后将10 mL预先保温在40℃，含有0.5％琼脂
原生质体数
并混合了1mL原生质体悬液的YEPD高渗再生培养基倒入至底层平板中制成双层平板。

亦
可用涂布法，将纯化的原生质体悬液，适当稀释后，各取0.2mL，涂于含有2.5%琼脂的20 mL高渗YEPD再生培养基上，对照用无菌水稀释原生质体，均匀涂布于YEPD表面。

30℃培养48h，分别记录长出的菌落数，并按以下公式计算出原生质体的再生率。

原生质体再生率=[（高渗YEPD长出的菌落数-对照YEPD长出的菌落数）/显微镜计数的
原生质体数] ×100%
2.3原生质体的融合
2.3.1加入助融剂
将双亲原生质体悬液(5×107~10×107个/mL)各3mL混合，离心(3000r/min，10min)弃上
清后，加入3mL助融剂，轻轻振荡，悬浮原生质体并置30℃恒温水浴保温20min。

每隔
3~4min轻轻摇动一次，使助融剂与原生质体充分接触，然后立即加入10 mL高渗YEPD培
养基，离心(6000 r/min，10min)，弃上清液可获得融合沉淀物(即原生质体融合物)。

2.3.2稀释及涂布
用0.6 mol/L NaCl悬浮以上获得的原生质体融合物，并进行稀释至10-3，分别从10-2、
10-3中取100~µL，涂于YNB基本培养基平板上。

2.3.3选择融合子及计算融合频率
将以上培养物于30℃培养3~5d，从长出的菌落中选出融合子。

并同时在基本培养基上
作单独亲本株的原养型回复突变。

另取等量稀释液用相同方法于再生完全培养基中培养后，
并计算菌落数。

以上是测定融合频率的涂布法。

亦可用双层平板法，首先在培养皿铺一层含琼脂2.5%
的高渗YEPD再生培养基，制成底层平板，放温箱中烘数小时，使其表面脱水。

然后将10
ml预先保温在50 ℃下，并混合了0.1mL原生质体融合物的YNB高渗基本培养基倒入至底
层平板中，制成双层平板，同涂布法，置30℃培养3~5d，从长出的菌落中选出融合子。

按下列公式计算融合频率：
融合频率=[（融合子数*稀释倍数）/（再生培养基上生长的总菌落数*稀释倍数）]*100% 3实验结果与分析
3.1原生质体形成率
用新鲜制备的去壁酶液5ml，轻轻摇动，然后于30℃摇床振荡培养50min，根据2.1.3原
生质体的形成率计算公式，结果如表1.1所示。

酶液处理后，原生质体形成率分别达到
91.30%和96%，,其中酿酒酵母2.339的原生质体形成率较高，说明酶液的水解细胞壁效果
对酵母2.339的效果更为理想，有利于下一步原生质体融合。

表一原生质体形成率结果
2.70 6.30*108 6.90*10891.30%
2.339 1.92*109 2.00*10996.00%
3.2原生质体再生率
将双亲原生质体悬液分别用0.6mol/LNaCl稀释至10-5，用0.2ml涂布于YEPD高渗和
YEPD培养基中。

30℃培养48h，分别记录长出的菌落数，并用2.2中公式计算出原生质体
的再生率。

其结果如表二所示。

从表中可知，原生质体的再生率较低，可能是由于培养基的配制不规范，导致原生质体的再生不理想。

表二原生质体再生率结果
酿酒酵母菌株YEPD中的平均
菌落数
YEPD高渗长出
的平均菌落数
显微镜计数的原
生质体数
原生质体再生率
8
2.339 138 606 1.92*109 2.44%
3.3原生质体的融合率
将处理后的原生质体融合物，稀释至10-2、10-3，涂布于YNB和YEPD高渗培养基上。

3d后计算菌数，结果如表三所示。

结果显示，稀释倍数为10-2时，培养基上菌落连成菌苔，无法计数。

10-3稀释倍数下，YNB培养基上菌数生长茂密，但仍可计数。

表三原生质体融合率结果
稀释倍数YEPD高生长菌落数YNB生长菌落数融合频率10无法计数无法计数/
10-3442 1884 23.46%
4讨论
原生质体融合方法多样，基本的有化学法和物理法[2]。

常见的化学法有PEG结合Ca2+、PH诱导法。

化学方法的优点是不需要特别的仪器，操作简单，但其化学物质存在一定的毒性，融合率不高。

物理方法有电融法和激光诱导融合法。

电融合法的有无毒、直观、融合效率高等优点。

激光诱导融合法毒性小，损伤小，但由于设备复杂，操作难度大，融合率低等缺点难以大
范围使用，尚处在发展阶段。

本实验采用化学方法，得到的原生质体融合率为23.46%，根据王娟娟的等人的研究，采用电融合技术，添加PEG助融剂可使双亲融合率达到70%-80%，融合率极高，可见，本
次试验中融合率较低，有待进一步完善。

实验中，两种酵母的原生质体再生率很低，可能
是由于YEPD及YEPD高渗培养基的配制不规范，导致培养基中成分改变，不符合原生质体
再生的培养条件，导致原生质体再生率较低。

原生质体融合技术是现阶段菌种改良的重要技术手段，但在原生质体融合过程中，如提高融合率，培养新的优良性状，保持遗产的稳定性的问题，还有待进一步的研究。

参考文献
[1] 黎永学, 张德纯, 李代昆. 双歧杆菌杆和酿酒酵母原生质体融合子筛选方法的探究[J]. 食品科学, 2006, 27(2):85-86.
[2]王娟娟, 贾彦军. 微生物原生质体融合方法的综述[J]. 畜牧兽医科技信息, 2005, 10:10-15.。