酵母原生质体融合

酵母原生质体融合

生态学院生物11 20号李香

酿酒酵母，又称面包酵母或出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，广

泛的用于制作面包和馒头等食品及酿酒，是发酵中最常用的生物种类。酿酒酵母的细胞为

球形或者卵形，直径5–10μm。其繁殖的方法为出芽生殖。

酵母菌种优劣直接影响发酵产品的价值，在自然界中菌种大多不具有较高的价值，因

而对菌种的选育和改良显得尤为重要。原生质体融合是一项应用广泛的菌种改良技术。原

生质体融合 (protoplast fusion)是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成

原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加入物理的或化学的或生物的助融条件，使双亲

株的原生质体间发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，进而发生基因组间的交换重

组，可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来。从而获得带有双亲性状的、遗传性能

稳定的融合子(fusant)的过程[1]。目前常用的融合方法有化学融合、生物融合、电融合以及激光诱导融合等。

本实验用酿酒酵母2.339与酿酒酵母2.70作为融合双亲，进行融合，旨在计算两种菌原生质体的形成率、再生率及融合率。望能将融合后的原生质体应用于酿酒生产中以获得

较高的经济效益。

1材料

1.1样品

菌种：酿酒酵母(Saccharomgces cerevisiae)的两种营养缺陷型菌株(如met-、lys-)。

1.2 培养基和试剂

(1)马铃薯培养基：马铃薯(去皮) 200g，葡萄糖20g，水1000 mL。配制方法下：将马铃薯

去皮，切成约2cm2的小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加糖，在补足水分1000 Ml,自然pH。

(2)YEPD培养基(用于酵母原生质体融合)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄20g蒸馏水1000 mL，pH6.0。

(3)YEPD高渗培养基(含0.6 mol/L NaCl的YEPD)：在YEPD培养基中0.6mol/L NaCl，3％

琼脂。

(4)YNB基本培养基：0.67%酵母氮碱基(YNB，不含氨基算，Difco)，2%葡萄糖，3％琼脂，pH6.2。另一配方为：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 1g，K2HPO4 0.125g，(5)KHPO4 0.875g，KI 0.0001g，MgSO4•7H2O 0.5g，CaCl2•2H2O 0.1g，微量元素母液1mL，微生素母液1mL(母

液均按常规配制)，水1000 mL，pH5.8~6.0。

(6)YNB高渗基本培养基：在YNB基本培养基中加入0.6 mol/L NaCl。

(7)预处理液：EDTA-巯基乙醇液，由0.1 mol/L EDTA配制成0.4%巯基乙醇。

(8) 原生质融合助融剂：30％PEG6000、0.1 mol/L CaCl2、pH7.0。

(9) 去壁酶液：1%蜗牛酶、0.6 mol/L NH4Cl、50 mol/L DTT(二硫苏糖醇)，过滤除菌。

(10)生理盐水(0.85%NaCl)

(11) 0.6 mol/L NaCl

(三) 实验用具

试管、三角瓶、摇床、恒温培养箱、恒温水浴锅、离心机、接种环、移液管、酒精灯、分

光光度计。

2实验方法

2.1原生质体的制备

2.1.1收集菌体

从斜面上取两亲本菌株各一环酵母菌分别接种于5 mL含有YEPD液体培养基的试管中，30℃静置培养24 h后，取0.3~0.5 mL转接至装有50mL新鲜YEPD培养基的250 mL

三角瓶中，摇床30℃培养至对数早期(14～16h)，细胞数达107-108/mL。离心(4000r/min，

10min)收集菌体。

2.1.2菌体的预处理

菌体用生理盐水洗两次(离心条件同前)，去上清液后，于离心管中加入预处理液(其用

量约为每克湿重菌体用4mL处理液)，30℃，30min，离心(1000 r/min)，10 min，取沉淀物。

2.1.3酶液处理去壁

于上述离心管中加入新鲜配制的酶液5~10 mL (酶液用量约为1%~2%)，轻轻摇动，悬

浮细胞，然后于30℃摇床轻轻振荡(100r/min)培养50~60min，每隔20min取样于相差显微

镜下观察，绘图并计数原生质体的形成率(按下列公式计算)。待90%以上细胞都形成原生

质体后，离心(2000r/min，5min)去除酶液，并用0.6 mol/L NaCl洗涤两次(离心条件同上)，

用4 mL 0.6 mol/L NaCl将原生质体制成悬液，备用。

原生质体形成率=[原生质体数/(原生质体数+完整细胞数)]*100%

2.2原生质体的再生

将原生质体包埋于半固体琼脂中，并倾注于再生基本培养基上，这是双层培养法，可

大大提高原生质体再生率。首先在培养皿中铺一底层含琼脂2.5％的高渗YEPD再生培养基，放温箱中烘数小时，使其表面脱水。然后将10 mL预先保温在40℃，含有0.5％琼脂

原生质体数

并混合了1mL原生质体悬液的YEPD高渗再生培养基倒入至底层平板中制成双层平板。亦

可用涂布法，将纯化的原生质体悬液，适当稀释后，各取0.2mL，涂于含有2.5%琼脂的20 mL高渗YEPD再生培养基上，对照用无菌水稀释原生质体，均匀涂布于YEPD表面。30℃培养48h，分别记录长出的菌落数，并按以下公式计算出原生质体的再生率。

原生质体再生率=[（高渗YEPD长出的菌落数-对照YEPD长出的菌落数）/显微镜计数的

原生质体数] ×100%