桂枝加芍药汤颗粒指纹图谱及多指标成分含量测定方法研究

实验研究
CHINESE COMMUNITY DOCTORS
中国社区医师2018年第34卷第18期
桂枝加芍药汤出自《伤寒论》，常用于施治脾阴亏损、肠道失润所致便秘、腹胀满、口唇干燥的老年习惯性便秘患者[1]。

本方由桂枝、白芍、生姜、大枣、炙甘草组成。

方中重用阴柔之芍药滋养脾阴，复用味甘之炙甘草、大枣佐芍药补益脾阴[2]。

方中用桂枝、生姜等阳药是为脾阴不足、运化失职、气机壅遏所致之腹胀满而设。

如此配伍，动静结合，共奏滋养脾阴、调畅气机之功，则斯症愈矣。

桂枝加芍药汤作为中药传统经典方已经经过了长期的临床使用，不仅具有疗效确切以及不良反应较少的优势，而且来源于传统，更突出了中医药特色。

但是通过检索文献发现，未能检索到对桂枝加芍药汤质量控制的方法。

桂枝加芍汤中活性成分复杂多样，为弥补质量评价的不足，本实验采用高效液相色谱法建立了桂枝加芍汤颗粒的指纹图谱，并同时对其中3种活性成分进行控制，从而为深入研究桂枝加芍汤颗粒的药效物质基础、配伍基础提供了有效的分析手段，为经典名方的开发
提供参考依据。

材料
仪器：岛津高效液相色谱仪(LC-2010A)，KQ-3000DB 超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；Mettler Toledo AL104电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司，精度：0.001g)，Mettler Toledo XP26电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司，精密度：0.01mg)。

试药：乙腈(色谱纯，4L/瓶飞世尔批号：146971)，水为屈臣氏蒸馏水(4.5L/瓶，广州屈臣氏食品饮料有限公司北京饮料分公司)，磷酸为分析纯(500mL/瓶，国药集团化学试剂有限公司，批号：20141104)。

桂枝加芍药汤颗粒由北京康仁堂药业有限公司自制
[3-5]
；芍药苷对照
品(批号：110736-201640，购于中国食品药品检定研究院)；甘草苷(批号：111610-201106购于中国食品药品检定研究院)；甘草酸铵对照品(批号：110731-201116，购于中国食品药品检定研究院)。

方法与结果
色谱条件：①色谱柱：美国安捷伦科技有限公司Agilent C18(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长267nm ，流速1mL/min；②柱温：25℃；进样量10μL；③流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)采用下表梯度洗脱[6]。

见表1，进样量10μL，色谱图，见图1。

供试品溶液的制备：取桂枝加芍药汤颗粒约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加蒸馏水50mL，称定重量，超声处理15min，使溶解，放冷，再称定重量，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性样品制备：制备缺白芍、缺炙甘草阴性样品，按供试品溶液制备方法
桂枝加芍药汤颗粒指纹图谱及多指标成分含量测定方法研究
李明1李蕊2张佳诺1付静2
100000北京中医药大学东直门医院1100000北京康仁堂药业有限公司2
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2018.18.002摘
要
目的：探讨桂枝加芍药汤颗粒指纹图谱及多指标成分含量测定方法。

方法：采用岛津高效液相色谱仪
(LC-2010A)，以乙腈-0.1%磷酸为流动相进行梯度洗脱，对标志性成分进行测定。

结果：建立了桂枝加芍药汤指纹图谱、标定了5个共有峰，指认其中3个峰并对其进行含量测定。

结论：本研究所建立的指纹图谱及多指标含量测定方法能较好地评价桂枝加芍药汤颗粒的质量，并可提高该制剂的质量标准，为保证产品质量奠定基础。

关键词桂枝加芍药汤；HPLC 指纹图谱；芍药苷
Study on the fingerprint and determination method of multi index component content of Guizhi and Shaoyao decoction
granule
Li Ming 1,Li Rui 2,Zhang Jianuo 1,Fu Jing 2
Dongzhimen Hospital of Beijing University of Chinese Medicine 1000001Beijing Kangrentang Pharmaceutical Limited Company 1000002
Abstract Objective:To explore the fingerprint and determination method of multi index component content of Guizhi and Shaoyao decoction granule.Methods:The Daojin high performance liquid chromatograph(LC-2010A)was used,gradient elution was carried out with acetonitrile-0.1%phosphoric acid as the mobile phase,we measured the markers.Results:We had established the fingerprint of Guizhi and Shaoyao decoction,calibrated 5common peaks,and identified three peaks and measured them.Conclusion:The fingerprint and multi index determination method established in this study can better evaluate the quality of Guizhi and Shaoyao decoction granule.It can improve the quality standard of the preparation and guarantee the quality of the product.Key words Guizhi and Shaoyao decoction;HPLC
fingerprint;Paeoniflorin
7
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制备阴性溶液。

对照品溶液的制备：精密称取芍药苷适量，加甲醇制成每1mL 含芍药苷60μg；精密称取甘草苷、甘草酸铵对照品适量，加70%乙醇制成每1mL 含甘草苷20μg、含甘草酸铵0.2mg 的混合对照品，即得。

方法学考察[7，8]：①精密度试验：取同一供试品溶液，在2.1项下的色谱条件下重复进样6次，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积(参比峰为甘草苷)的RSD 均＜3%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求。

②稳定性试验：取同一供试品溶液，在2.1项下的色谱条件下，分别在0、2、4、8、12、24h 进样，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 均＜3%，表明供试品溶液在24h 稳定。

③重复性试验：取同一批桂枝加芍药汤颗粒6份，按2.2项下制备供试品溶液，在2.1项下的色谱条件下，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 均＜3%表明该方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求。

指纹图谱建立及相似度分析：桂枝加芍药汤颗粒的HPLC 指纹图谱的建立：取10批桂枝加芍药汤颗粒样品，分别按供试品溶液的制备和检测方法进行检测，记录指纹图谱。

因甘草苷峰面积相对加大且稳定，故以其为参照峰，计
算各共有峰相对保留时间，10批样品共有峰相对保留时间的RSD 均＜0.5%符合指纹图谱的要求。

运用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”对10批样品的指纹图谱进行分析，设定样品1为参照图谱。

选取9个特征峰进行多点校正，自动匹配，生成对照指纹图谱，见图2。

匹配后的10批样品谱图见图3，然后进行各样品相似度评价，样品1～10的相似度分别为0.987、0.978、0.987、0.988、0.994、0.978、0.979、0.981、0.979、0.971。

10批桂枝加芍药汤颗粒指纹图谱相似度均＞0.90，符合指纹图谱要求。

含量测定方法与结果[9]
色谱条件：按2.1项下色谱条件进行检测，以3种对照品计算理论塔板数＞5000，分离度＞1.5。

对照品溶液的制备：精密称取芍药苷适量，加甲醇制成每1mL 含芍药苷60μg；精密称取甘草苷、甘草酸铵对照品适量，加70%乙醇制成没1mL 含甘草苷20μg、含甘草酸铵0.2mg 的混合对照品，即得。

对照品溶液的制备：取桂枝加芍药汤颗粒约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加蒸馏水50mL，称定重量，超声处理15min，使溶解，放冷，再称定
重量，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

线性范围的考察：精密称取芍药苷对照品12.18mg，置于100mL 容量瓶中，加甲醇使溶解，定溶至刻度，摇匀。

分别吸取1mL、3mL、5mL、7mL、9mL、10mL 溶液置10mL 容量瓶中，加甲醇定溶至刻度，即得。

取芍药苷对照品溶液10μL 注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定，记录峰面积，以色谱峰的峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，求得芍药苷的回归方程y=14011x +14883(R 2=0.9999)(R 2=0.9999)，表明芍药苷0.122～1.218μg 范围内线性关系良好。

精密称取甘草苷、10.08mg 甘草酸铵对照品10.27mg，置50mL 容量瓶中，加70%乙醇使溶解，定容至刻度，摇匀。

分别吸取1mL 、3mL、5mL、7mL、9mL、10mL 溶液置10mL 容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，即得。

取甘草苷、甘草酸铵混合对照品溶液10μL 注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定，记录峰面积，以色谱峰的峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，求得甘草苷的回归方程为y=2E +06x-3975.9(R 2=0.9999)，表明甘草苷在0.202～4.032μg 范围内线性关系良好。

求得甘草酸铵的回归方程y=533487x +8668.2(R 2
=
5.010.015.020.025.030.035.040.045.050.0min
8.07.06.05.04.03.02.01.00.0
mV(×10)图1供试品HPLC 指纹图谱图2
桂枝加芍药汤颗粒的对照指纹图谱
图310批桂枝加芍药汤颗粒的HPLC 指纹图谱图4芍药苷对照品标准曲线
2345678910111213141516171819202122232425262728293031323334353637383940414243444546474849505152535455
2
3
4
5
6
7
8
910111213141516171819202122232425262728293031323334353637383940414243444546474849505152535455
时间(min)
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0.9995)，表明甘草酸铵在0.201～4.025μg范围内线性关系良好。

见图4～6。

准确度实验：精密称取桂枝加芍药汤颗粒6份，每份0.5g，置于50mL容量瓶中，加水适量，超声溶解后，加入浓度为1.3920mg/mL的芍药苷、0.1826 mg/mL甘草苷、0.4264mg/mL的甘草酸胺混合对照品溶液5mL，加水定容至50mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

按2.1项下色谱条件测定，测定芍药苷、肉桂酸、甘草苷的含量，并计算回收率，芍药苷平均回收率为104.1%，RSD为0.39%，甘草苷平均回收率为100.12%，RSD为2.72%，甘草酸铵平均回收率为100.45%，RSD为1.97%，回收率符合相关要求。

见表2。

专属性实验：将2.3项所获得的阴性供试品溶液按2.1项下色谱条件进行测
定，所得结果无阴性干扰，故本方法专
属性较好，见图7。

样品测定：精密称取10批桂枝加芍
药汤颗粒，分别按2.2项下制备供试品，
按2.1项下条件测定，见表3。

讨论
指纹图谱与一测多评结合的优势：
由于桂枝加芍药汤颗粒成分复杂多样，
目前还没有针对桂枝加芍药汤相关的质
量控制方法出现，故本实验采用梯度洗
脱对桂枝加芍药汤颗粒中芍药苷、甘草
苷、甘草酸铵含量进行测定，并同时建
立了指纹图谱的研究方法。

将指纹图谱
技术与多指标成分定量技术相结合，建
立了桂枝加芍药汤配方颗粒的质量控制
方法。

定量指标的选择：桂枝加芍药汤中
白芍养营阴，缓肝急，止腹痛。

炙甘草
益气和中，调和诸药。

故本研究选取其
中相对稳定的芍药苷、甘草苷、甘草酸
铵作为质量控制成分；适合对桂枝加芍
药汤颗粒质量进行完整表达。

色谱条件的选择：本实验参照相关
文献，选择峰强度及分离度相对较好的
267nm作为检测波长，通过实验考察将
乙腈-0.1%磷酸溶液作为梯度洗脱流动
相，得到的色谱峰分离效果好，样品获
得了合适的保留值，通过方法学的验
证，所得检测结果RSD值均符合要求，
故以上述建立的指纹图谱结合多指标成
分定量方法及样品处理条件对桂枝加芍
药汤颗粒进行指纹图谱比对及定量分析
是可行的。

图5甘草苷对照品标准曲线图6甘草酸铵对照品标准曲线
(下转第11页)
·社区用药指导
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究认为花色素类、石榴酸及其共轭三烯异构体、石榴子含有多种生理活性成分，具有抗氧化性。

畅静研究认为多酚类物质是石榴中的主要生物活性成分[7]
，
具有抗氧化；闫林林选取山东、新疆两大石榴产区的玻璃翠、大马牙、青皮、和田石榴、嗜什及皮亚曼6个主要栽培品种[8]
，认为石榴果实中石榴皮的抗氧化
活性最强。

主要成分分析方面：在试验结束后，调查人员便对不同石榴品种的主要成分进行相应程度的分析，在对其进行分析研究的过程中，发现在不同石榴品种具有不同成分的情况下，固酸比等含量将会处于不同的发展趋势中。

酸比与石榴果实含量处于负向相关的关系中，对于不同品种而言，当石榴中具有较多成分的时候，固酸比便会处于较大的发展趋势中。

不同成分中，固酸比具有不同的发展趋势，对于花青苷等不同成分而言，都具有不同的数据结果，从而在调查人员对数据结果进行不断分析的基础上，便得出相应的结论。

闫林林选取
山东、新疆两大石榴产区的玻璃翠、大马牙、青皮、和田石榴、嗜什及皮亚曼6个主要栽培品种，认为石榴果实中多酸类物质主要富集在石榴皮中，石榴皮提取物中主要酚酸类成分有没食子酸、安石榴林、安石榴苷、鞣花酸及其衍生物。

相关性分析方面：依据调查结果，可对单果质量进行较大程度的分析，使其处于完善的发展，可溶性酸与固酸比而言，两者具有一定程度联系，呈现一种负向相关的发展模式。

在两者处于不断联系状态下的时候，同时，在对不同石榴品种进行调查的过程中，对石榴品种的相关性进行不同程度的分析，由此，便得出不同的结论，进而使石榴处于完善的发展模式中，促进人类对研究结果的分析。

不同石榴品种果实，酚类物质和抗氧化能力具有不同的变化发展趋势，在人类对石榴品种果实进行不断研究的情况下，将能使人类对农业具有更好的理解。

我国研究者要加强对不同的石榴的分析、研究，不断挖掘石榴的潜在价值。

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10
20
30
40
50
60
1.25
1.000.750.500.25
0.00
图7阴性供试品图谱
(1.芍药苷对照品；2.甘草苷、甘草酸铵对照品；3.缺炙甘草阴性样品；4.缺白芍阴性样品；
5.桂枝加芍药汤颗粒样品)
(上接第9页)。