基因工程ppt05

⒈ GST融合表达载体
GST表达载体包括：一系列pGEX载体（图5-4）。 如pGEX-4T-1，在启动子tac和多克隆位点之间加入了两 个与分离纯化有关的编码序列，①谷胱甘肽-S 转移酶 基因，②凝血蛋白酶（thrombin）切割位点的编码序列。 当外源基因插入到多克隆位点后，可表达出由三部分序 列组成的融合蛋白。? GST是来源于血吸虫的小分子酶（26kDa），在E.coli易 表达，在融合蛋白状态下保持酶学活性，对谷胱甘肽有 很强的结合能力。利用这些性质可用来分离纯化表达的 目的蛋白。
16S rRNA--------------UCCUCCA AGGAGGU 5’mRNA----GAUUCCU
---------------------------16S rRNA
UUGACCU--AUG-CGA-GCU-UUU-AGU f--Met--Arg--Ala---Phe---Ser –
第5章 表达载体
大肠杆菌表达载体
大肠杆菌表达载体的结构 利用T7噬菌体启动子的表达载体 表达融合蛋白的表达载体 表达产物的纯化
穿梭载体
5.1 大肠杆菌表达载体
5.1.1 大肠杆菌表达载体的结构
大肠杆菌表达载体都是质粒载体。 表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求，即能将外 源基因运载到大肠杆菌细胞中。 基本骨架是最简单的质粒克隆载体中的复制起点和氨苄 青霉素抗性基因，相当于pUC类的载体。 在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。 各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。
图5-5 组氨酸标签表达载体pET-16b图谱及其克隆 和表达部位的序列
克隆和表达部位的序列（提问）
⒊ 内含肽标签表达载体
将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽（intein）中间，在得 到融合蛋白以后不通过蛋白酶水解就可将标签蛋白切除。 例如载体pTWIN1，利用T7噬菌体启动子，其后依次为几丁质结 合域（chitin binding domain, CBD）、intein1、多克隆位 点、intein2和CBD。 intein1来自一种蓝细菌dnaB基因产物的微型intein，在特定pH 和温度下，在该intein的C端发生水解，从而将intein与其下游 的多肽序列分开。 intein2是来自蟾蜍分枝杆菌gyrA基因产物（pTWIN1）或热自 养甲烷杆菌rir1基因产物（pTWIN2）的微型intein，可在其N端 进行巯基诱导的水解，利于目的蛋白形成二硫键。
⒈ 表达元件
⑴ 启动子
转录是由RNA聚合酶在启动子部位启动RNA转录的过程。 当转录启动以后，RNA聚合酶对启动子下游要转录的序 列是无法识别的，这就为利用强启动子来表达目的基 因提供了可能。 主要3类启动子：乳糖操纵子lac基因的启动子及其与 色氨酸合成操纵子中trp启动子拼接形成的杂合启动子 tac或trc，所有这些启动子都受IPTG诱导；T7噬菌体 启动子；噬菌体的PL启动子。(注意：表示方法）
(2) 噬菌体的PL启动子受cⅠ基因产物的调节，cⅠ阻抑物 抑制转录的启动。 利用PL启动子的载体一般在噬菌体溶原的大肠杆菌中 表达。 溶原性噬菌体上的cⅠ基因是温度敏感的，如M5219菌 株含有cⅠts857突变。在低温（30℃）下，该突变的 cⅠ阻抑物能抑制PL启动子的转录，而在高温下（4045℃）失去活性，PL启动子的活性不受抑制。
融合蛋白的剪切点
启动子
担体蛋白 目的蛋白 终止子
⒉ 组氨酸标签表达载体
利用组氨酸标签的表达载体有很多，如pET-16b。 主体框架与pET-5a相似，除了多一个lacⅠ基因外，启动 子下游含有一段编码6个组氨酸的序列和编码Xa因子酶切 位点的序列。当外源基因插入到BamHⅠ等位点后，在 BL21（DE3）菌株中可表达出带His-6 标签的融合蛋白的。 多聚组氨酸肽能与二价重金属阳离子结合，如镍离子 （Ni2+）。 将镍离子固定在树脂上，便可对带His标签的融合蛋白进 行亲和层析分离。 纯化的融合蛋白再用Xa因子处理，可去除标签多肽获得 纯化的目的蛋白。
5.1.4 表达产物的纯化
⒈包涵体蛋白的纯化(inclusion bodies)
菌体的破碎:机械法、超声波处理等方法破碎表达外源
蛋白的细胞，离心获得包涵体。 包涵体的洗涤:常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、 Triton和 NP40等加EDTA和DTT、β-巯基乙醇等反复多 次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强， 在洗涤包涵体时可加50 mM NaCl。 溶解:包涵体中的蛋白质必须释放出来，才能满足研究 的需要。通常利用盐酸胍、尿素和SDS等溶解包涵体， 再通过一定的方法使蛋白质重新折叠。
目的蛋白
几丁质结合域 T7启动子 内含肽1 多克隆位点 克隆、表达 几丁质结合域 内含肽1 目的蛋白 过柱、洗涤 几丁质 内含肽2
图5-6 表达载体 pTWIN1工作原理 及其产物纯化示 意图
pH7，室温，自然水解
洗脱 目的蛋白
产物纯化
在pTWIN1中，当外源目的基因插入多克隆位点并带有自 身的翻译终止密码子时，可表达出目的蛋白N末端带有 CBD和intein1的融合蛋白（图5-6）。 表达该融合蛋白的细胞抽提物流过几丁质树脂层析柱时， 融合蛋白就被吸附在树脂上，通过洗涤可将其他蛋白去 除。 然后调节层析柱的pH至7.0并于室温放置，此后目的蛋 白与intein之间发生水解，最后通过洗脱便得到纯化的 目的蛋白。
S-D序列与16SrRNA结合示意图
图5-1 大肠杆菌表达载体pKK223-3图谱(无融合载 体)
基本骨架来自pBR322 和pUC8的质粒复制起 点和氨苄青霉素抗性 基因。 在表达元件中，有一 个杂合tac强启动子 和终止子，在启动子 下游有RBS位点，其 后的多克隆位点可装 载要表达的目的基因。
图5-7 分泌表达载体pEZZ18图谱
表达元件: Plac 蛋白A信号肽（S) 蛋白A的ZZ功能域 纯化方式： 固定了IgG的琼 脂糖柱，与ZZ 功能域结合
pEZZ18
表达元件:lac启动子、蛋白质A的信号肽序列和两 个合成的Z功能域（domain）。 蛋白质A:来自金黄色葡萄球菌，具有与抗体IgG结 合的能力，Z功能域就是根据蛋白质A中结合IgG的B 功能域而设计的。 融合蛋白表达后，在信号肽序列的指导下，分泌到 培养基中。 用固定了IgG的琼脂糖层析柱，通过与ZZ功能域的 结合而得到纯化的融合蛋白。 这个14kDa的“ZZ”肽链对融合蛋白的正确折叠几乎 没有影响。
⑵ 终止子
转录会受到模板RNA序列结构的影响，当遇到颈环 结构时转录便会停止，或遇到ρ因子介导的终止信 号转录也会停止。
⑶ 核糖体结合位点
转录出来的mRNA可在宿主细胞的翻译机器作用下翻 译出目的蛋白。 细胞中的核糖体必须在mRNA上找到有效的核糖体结 合位点以及其中的Shine-Dalgarno序列（SD序列）， 从而启动邻近其下游的翻译起始密码子的蛋白质翻 译。 （表示方法：RBS,rbs，DNA or mRNA上 )
⒊ 表达的控制
通过诱导来控制的，不同的启动子使用的诱导方式不 同。通过诱导，可防止基础表达（渗漏表达），特别 是可防止某些有毒产物对细胞的毒害。 (1) 启动子lac及其衍生启动子tac都是诱导型启动子， 在IPTG诱导下启动转录。从lac启动子的诱导机制来 看，在没有诱导物时，宿主细胞表达的lac阻抑物阻 断转录的启动。 过量阻抑物阻断基础表达:在载体上装载一个lacⅠq 基因阻抑物编码基因，从而达到严谨调节的目的。
图5-4 GST融合表达载体pGEX图谱
分离纯化表达的目的蛋白
吸附：将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱， 当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱时，融合蛋 白将吸附在树脂内，其它细胞蛋白就被洗脱出来。 洗脱：含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱，可将融 合蛋白释放出来。 酶切：用凝血蛋白酶切割融合蛋白，获得纯化的目的蛋 白。 除凝血蛋白酶的切割位点外，其他还有Xa因子（Factor Xa）和肠激酶（PreScission Protease, enterokinase） 切割位点。
纯化:
⒉ 可溶性蛋白的纯化
在超量表达体系中，大部分蛋白会形成包涵体。 少量蛋白会进入细胞周质区，呈现可溶性状态。 从细胞破碎液的上清液中纯化的可溶性表达产物，一般 可展现应有的活性。 融合蛋白的表达标签可用于分离纯化目的蛋白，分泌表 达载体也有助于分离纯化可溶性的表达产物。
5.2 穿梭载体
⒋ 分泌表达载体
表达的蛋白分泌到细胞外或细胞周质区中。 可避免细胞内蛋白酶的降解，或使表达的蛋白正确折叠， 或去除N-末端的甲硫氨酸，从而达到维护目的蛋白活性 的目的。 利用信号肽序列作为融合标签可将融合蛋白分泌到细胞 外，可利用的信号肽有碱性磷酸酶的信号肽和蛋白质A 的信号肽。 pEZZ18表达载体利用了蛋白质A的信号肽（图5-7）。
穿梭载体（shuttle vector）是能够在两类不同宿主中 复制、增殖和选择的载体，如有些载体既能在原核细胞 中复制又能在真核细胞中复制，或能在E.coli中复制又 能在革兰氏阳性细菌中复制。 这类载体主要是质粒载体。
图5-3
大肠杆菌中T7启动子表达调控模式图
5.1.3 表达融合蛋白的表达载体
通过融合蛋白的形式表达，并利用载体编码的蛋白或多 肽的特殊性质，可对目的蛋白进行分离和纯化。 用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 （Tag），常用的有谷胱甘肽S转移酶（glutathione Stransferase, GST）、六聚组氨酸肽（polyHis-6）、 蛋白质A（protein A）和纤维素结合域（cellulose binding domain，CBD）等。 需要记住的符号： Tag， glutathione S-transferase, GST， polyHis-6
5.1.2 利用T7噬菌体启动子的表达载体
pET载体及其表达系统
pET-5a：在载体的基本结构上加入了T7噬菌体启动子序 列及其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶 切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。 T7噬菌体启动子：只能由T7噬菌体的RNA聚合酶识别并 启动转录，而大肠杆菌的RNA聚合酶不能作用于T7噬菌 体启动子。用于表达的宿主细胞必须能表达T7噬菌体的 RNA聚合酶。 常用的pET表达载体的宿主菌：大肠杆菌BL21（DE3）
⒉ 表达形式
直接转录并翻译出目的基因ORF对应的氨基酸序列，即 表达出完整的目的蛋白。 目的基因以融合蛋白的形式进行表达。
pKKFra Baidu bibliotek23-3
终止子： 5SrRNA 区域（rrnB 操纵子区域），rrnBT 和 rrnBT2 终止子（ 防止通读）。 受 lac 阻抑物调控， 1-5mM IPTG 诱导。 可直接表达任何含 RBS 和 ATG 的基因，若无 RBS，其 ATG 需与固有RBS相隔5-13bp。
图5-2 大肠杆菌表达载体pET-5a图谱
T7 tag: T7基因10蛋白的氨基末端11aa
控制外源基因严谨表达的2个系统
通过宿主控制T7 RNA聚合酶的量来实现的，即在宿主细胞中引 入一个带有T7噬菌体的溶菌酶编码基因的质粒，如pLysS或 pLysE，它们分别低量和高量表达T7噬菌体的溶菌酶。该溶菌酶 可抑制T7 RNA聚合酶的活性，从而减少在未诱导情况下外源基 因的表达。 使启动子的控制效应更严谨。在pET载体上装载lacⅠ基因，提 高阻抑物的浓度。 也可利用T7-lac启动子（在T7启动子序列下游装入一个由25bp 组成的lacO操纵子序列），当阻抑物结合在lacO位点时，即使 存在T7 RNA聚合酶，外源基因也无法表达。 只有当诱导物存在时，才能解开T7 RNA聚合酶基因和外源基因 表达的双重阻遏。 图5-3是T7启动子在大肠杆菌中的表达调控模式示意图。