_聚谷氨酸的微生物合成与应用

新品介绍

γ2聚谷氨酸的微生物合成与应用

施庆珊Ξ

(广东省微生物研究所,广东广州510070)

摘　要:γ2聚谷氨酸为一种水溶性的、可生物分解和可食用且对人和环境无毒的生物高分子产品,这些特性使得γ2聚谷氨酸及其衍生物在过去几十年来在食品、化妆品、医药和水处理等领域有广阔的应用前景。国外在γ2聚谷氨酸的研发及生产方面已经非常领先,已有产品规模生产,相比之下,我国在这方面还处于起步阶段,研究仅限于实验室阶段,离产业化还有很长一段距离。本文介绍了微生物合成γ2聚谷氨酸的方法,γ2聚谷氨酸的理化特性及用途。

关键词:γ2聚谷氨酸;微生物合成;氨基酸

Biosynthesis and Application of γ2Polyglutamic Acid

S HI Qi ng 2shan

(Guangdong Institute of Microbiology ,Guangzhou 510070,China )

Abstract :γ2Polyglutamic acid (γ2PG A )is a biopolymeric product exhibiting water solubility ,biodegradation ,edibil 2ity and non 2toxicity to human and environment ,making its wide application in many fields as food ,cosmetics ,medicine and water treatment in the past pared with advanced level in research and commercial production of γ2PG A abroad ,China has a long way to go as its situation of researching is still in laboratory.This article focuses on the biological synthetic method for γ2polyglutamic acid ,its physical and chemical performances and usages of γ2PG A.

K ey w ords :γ2polyglutamic acid ;biosynthesis ;amino acid

氨基酸聚合物可分为两类:一类是氨基酸的天

然聚合物———蛋白质、多肽激素、酶及活性肽;一类是人工或生物方法合成的聚合物,它包括天然活性肽及其类似物,如催产素、加压素、释放素L HG 类似物、聚谷氨酸(以下简称γ2P G A )、聚赖氨酸和聚精氨酸等。获得氨基酸聚合物的方法有两种:一是通过生物方法大量积累产物后提取或从天然物质中提取;二是人工合成。人工合成有单一氨基酸组成的均聚氨基酸主要有3种:一是利用碳酰氯的NCA 法,二是氨基酸羟基转化为活性酯和氨基缩合的活性酯法,三是酶法合成。通过生物方法有廉价生产的可能性,对工业部门来说是很有用的。

1937年Ivanovics 等人首先发现炭疽芽孢杆菌的夹膜含有γ2聚谷氨酸(γ2P G A );1942年Bovar 2nick 等人发现有些芽孢杆菌属细菌能通过发酵培养

积累γ2P G A ;1973年Troy 发现γ2聚谷氨酸是

B acill us anthracis 细胞夹膜的一种化学组分,它是一种水溶性的酰胺化合物,可以通过芽孢杆菌的变

种来生产〔1,2〕

。γ2P G A 是从左旋2谷氨酸(有的菌种

可不必加L 2谷氨酸)经发酵而制成,为一种全天然、多功能性、生物降解的生物高分子产品,它由氨基酸单体通过均聚或共聚而成。由于主链上存在大量肽键,在体内极易受酶的作用,降解生成无毒的寡肽或谷氨酸,具有优良的生物相容性和生物降解性。聚谷氨酸分子链上具有大量活性较高的侧链羧酸(—COOH ),易于和一些药物结合生成稳定的复合物,可作为药物载体,也可借改性使之具有不同的性质,如高亲水性等(如适度交联形成三维空间的网络结构,即可制成高吸水性树脂),满足实际应用的不同

需求。γ2P G A 分子量范围从1万～200万,可以制

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02・Ξ

收稿日期:2004203201

　基金项目:广东省科学院自然科学基金项目(2002202205)　作者简介:施庆珊(19662),男,副研究员,从事工业微生物菌种选育及发酵工艺的研究和开发工作。

　Vol.12,No.11精细与专用化学品第12卷第11期Fine and Specialty Chemicals

2004年6月6日

成不同的分子量应用于各种不同领域。比如,γ2 P G A具食品安全性,可作为膳食纤维、保健食品、食品增稠剂〔3〕、安定剂或作为化妆品用的保湿剂〔4〕;γ2P G A可作成水胶,具有极高吸水能力,可吸水达3500倍〔5〕,极适合于农业土壤和环保产品之应用;γ2P G A可以转化成各种不同的金属盐类,具不同p H值,并有特殊的阴离子表面特性,适用于组织培养和许多其它行业如食品、化妆品、生物医学和工业的应用等。

1　聚谷氨酸的微生物合成

111　菌种

γ2P G A生物合成的微生物菌株主要是芽孢杆菌属的某些种,如 B.anthracis〔5〕和 B.licheni2 f ormis A TCC9945a〔6〕、B.lichenif ormis A TCC 9945〔7〕(以前叫B.subtilis A TCC9945)等。根据细胞生长的营养要求是否需要L2谷氨酸,可以把γ2 P G A产生菌分为两大类〔8〕,一类是培养时需要L2谷氨酸才能积累γ2P G A,这类菌种主要有 B.an2 thracis〔9〕、B.subtilis M R2141〔9〕、B.lichenif orm is

A TCC9945〔7〕、B.lichenif ormis A TCC9945a〔6〕、

B acill us subtilis I FO3335〔1〕和B acill us subtilis F222 01〔10〕等,一类是培养时不需要L2谷氨酸也能积累γ2P G A,如B.subtilis5E〔1〕、B.subtilis var.polyg2 l utam icum〔1〕、B.lichenif ormisA35〔11〕、B.subtilis2 TA M24〔12〕等。

112　发酵工艺

γ2P G A发酵生产所用碳源一般采用谷氨酸盐(也可作氮源)、葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘油、柠檬酸盐等,γ2P G A摇瓶发酵过程如下所示。

(1)斜面种接种于固体活化培养基(成分:胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl10g/L、琼脂20g/ L);菌种活化培养,置于37℃培养箱活化培养一天,再冷藏于4℃。

(2)将上述约1cm2面积之菌种刮下,接于100mL液态活化培养基(成分同前,但不加琼脂)中,置37℃,150r/m振荡培养2天。

(3)以1%(v/v)接种量接入摇瓶培养基中(成分:L2谷氨酸20g/L、柠檬酸12g/L、甘油80g/L、N H4Cl7g/L、K2HPO4015g/L、MgSO4・7H2O015g/ L、FeCl3・6H2O0104g/L、CaCl2・2H2O0115g/L、Mn2 SO4・H2O01104g/L,用酸或碱调节p H值为615);在37～40℃、150～250r/m摇床振荡培养3～4天。

(4)进行γ2P G A分离纯化及产量测定。

不同菌种、培养基和发酵工艺条件,γ2P G A的产率是不同的,一般产率在5～50g/L。某些菌种可用氯化铵代替L2谷氨酸钠作氮源进行发酵,由于培养基中不需提供谷氨酸,可显著降低发酵原料成本,但产率较低。

113　分离纯化

将发酵完毕的液体缓慢倒入离心管,置入超高速离心机,在4℃控温下以21000r/m离心20min,以去除菌体,并取其上清液。将上清液与乙醇以1∶4比例混和再置于超高速冷冻离心机中,在4℃控温下以21000r/m离心40min,最后将离心管底部的白色沉淀物取出,至于0～4℃冰箱冷冻干燥24h,既可得γ2P G A粗产品。粗产品可进一步溶解在100～200倍(w/v)的蒸馏水中,用浓硫酸调节p H值至310,然后用离子交换树脂脱盐,全部脱盐液冷藏3天,离心分离析出沉淀,得到的滤渣用甲醇洗净后, 40℃减压干燥2天,即可得到γ2P G A纯品。

2　聚谷氨酸的理化特性

211　化学结构

γ2P G A是一种水溶性的酰胺化合物,由单个谷氨酸分子在γ2羟基和α2氨基形成酰胺键而连接成的多聚体,见图1。

_NH CH

COOH

CH2CH2Cη

O

图1　γ2PG A的结构式〔1〕

212　物理性质

选用游离酸型的γ2P G A,根据滴定量测定p Ka 值,p Ka≈2.23,这与谷氨酸的α羧基的p Ka值大体一致〔13〕。金属盐(钠型)的γ2P G A的比旋光度= -710(C=110,H2O)。游离酸型的γ2P G A能够溶于二甲亚砜、热的N,N2二甲基酰胺和N2甲基吡咯烷酮。用DSC(示差热量分析)及G A(热重量分析)法研究了它的热性质,得出分解温度为23518℃、熔点为22315℃,热分解物为茶褐色。

213　分子量和光学异构体比

γ2P G A分子量的测定是采用Shimadzu6A GPC(G el Permeation Chromatography)色谱系统和6A折射指数侦察仪(Asahipak GS2620H)及Tosoh TSKgel GMPWXL凝胶柱在25℃中进行的。采用

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　2004年6月6日施庆珊:γ2聚谷氨酸的微生物合成与应用