薄层扫描法(TLCS)ppt课件

用曲线校正法校直Kubelka—Munk曲线，必须巳知薄层板的SX值， Mrck预制硅胶板的SX＝3，Merck预制氧化铝板的SX＝7，Wako预制 硅胶FM(硅胶GF254)板的SX＝7。国产预制薄层板及自制薄层板，可 参考上述数据试调，而后检查校正是否适宜，修正SX值再校，直至 A—KX曲线成直线为止。检查方法如下图所示。图中点样量显(横坐标) 常用单位为ug/点。
薄层扫描法 (TLCS)
2 主要功能
(1)可进行物质的紫外-可见原位吸收光谱测绘 紫外-可见吸收光谱既可作为物质定但的参考，又可提供待测物质的最 大吸收波长，以便进行色谱测定。 仪器在记录吸收光谱时，可提供两种方式。一种为标准方式(NORMAL)， 这种方式记录光谱进行波长扫描时，所测得光谱数据，一方面存入文件中， 同时也输出到记录器上。另一种方式为差示方式(DIFFERENCE)．它可将 测得光谱数据减去文件中存贮的光谱数据，并将其差值只输入到记录器中， 而不存贮在文件里。 要想得到校正过基线的正确光谱，应这样进行：先以标准方式，在巳展 开过的荡层板上无斑点的空白位置上，进行一次波长扫描，将基线光谱(它 反映空白板对各种技长光的吸收情况)存入文件中(亦可输出到记录器去)。 然后再用差示方式对待测斑点进扣波长扫描，就能得到扣除薄层空白板吸 收的待测物质的正确光谱图。 (2) 多通道自动扫描 仪器提供的程序方式(PROGRAM)，可完成冬通道 的自动扫描。程序方式中有七种参数供使用。它们包括波长1和波长2，用 来分别设定测量波长和参比波长，可以进行双波长扫描。
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1.3 Kubelka-Munk曲线校直
Kubelka－Munk曲线说明了薄层色谱斑点的吸光度与其浓度间 呈非线性关系，该曲线是薄层扫描法进行定量分析的理论依据。曲 线处理采用两类方法：曲线校直法及计算机回归法(线性及非线性 回归)。CS系列仪器采用前者，CAMAG仪器采用后者方法。 曲线校直法是根据薄层板的散射参数SX值，将Kubelka－Munk 曲线校正为直线，简化A与KX间的关系，以利于定量分析。
二、基本原理与方法
薄层扫描法可分为薄层吸收扫描及薄层荧光扫描 两类方法。 1. 薄层吸收扫描法的基本原理
薄层吸收扫描法是用可见光或紫外线的单色光照射展开后 的薄层色谱板，测定薄层色谱斑点(简称斑点)的吸光度(A)随展 开压离(L)的变化，而获得A—L成A—Rf曲线，即薄层色谱扫描 图(简称扫描图)。 曲线上的色谱峰峰面积可用于定量分析。由于薄层板存在 着明显的散射现象，而使斑点中物质的浓度与吸光度的关系不 服从Beer定律，需田Kubelka—Munk(古柏尔卡—曼克)理论来描 述。该方程式是薄层扫描法的定量分析基础。定量校正方法可 分为曲线校直法及非线性回归法等。
(2)在反射法中薄层色谱斑点的吸收度A：
反射法示意图
1.2 Kubelka—Munk曲线
Kubetka—Munk曲线是以薄层固定相不吸收照射光，即空白板的K ＝0为前提，按照空白板的散射参数，用KubeIka—Munk理论有关 方程式算出斑点的A—KX理论曲线。由于薄层固定相颗粒的散射作 用，对于透射法及反射法造成偏离Beer定律的影响正好相反，故需 按两种情况讨论。 （1）透射法的Kubelka—Munk曲线
式中的X为薄层厚度， SX含义同前，K为单位薄层厚度的吸光系数。 K虽称为“吸光系数”是因“单位厚度”而得名，它与分光光度法 中物质的吸收系数不向，与薄层色谱斑点中物质的浓度有关。KX称 为吸收参数，相当于薄层色谱斑点单位面积中物质的含量(ug／cm2)。
（2）薄层色谱斑点的反射率(R)
(3)薄层色谱斑点的吸光度(A)
反射式
2.1 扫描方式选择
(1) 直线扫描 直线式扫描是用一光带先照射在薄层板的一端，而后作直线 运动至另—端。在作直线式扫描时，实际上是光带固定，薄层板相 对于光带作直线运动。
在作直线扫描时，光带的长度对扫描后所得的色诺峰峰面积 影响很大，下图说明了光带越长，所得的色谱蜂面积越小，反之 则峰面积越大。光带太长，检测灵敏度低，光带太短，光带只通 过斑点的一部分，所得的蜂面积，不能真实反砍斑点的吸收情况。 因此，正常扫描时，应使光带长度略大于斑点直径。在多斑点扫 描的，光带长度略大于最大斑点直径。为了降低定量误差，应使 标准品斑点的直径与检品斑点的直径尽量接近。样品斑点为带状 时，光带长度应约为样带的2/3。
（2）反射法的Kubelka—Munk曲线
对比两图很易发现，由于薄层固定相的散射作用使在透射法中 所测得的斑点的吸光度产生正偏差，而在反射法测定时产生负偏差。 这是因为照射光被散射，降低了透射率，吸光度增加；散射光增加 了反射光光强，增加了反射率，而降低了吸光度的缘故。其次，还 可发现后图比前图的横座标大25倍，这说明了反射法的灵敏度(响 应值)比透过法小。
1.1 Kubelka—Munk理论
Kubelka—Munk理论说明了固定相的散射参数对斑点中物质的 浓度与吸光度间关系的影响。该理论的基本方程式如下。 （1）薄层色谱斑点的透射率：
上式是Kubelka—Munk理论描述薄层色谱斑点透光率的最基本公 式。式中Sx是薄层板的散射参数，它与固定相的种类、粒度、薄 层厚度及涂布均匀程度有关。其数值大小直接影响薄层色谱斑点 的吸光度—浓度曲线偏离Beer定律的情况。只有已知薄层板准确 的SX值，才能正确地运用曲线校直法进行薄层扫描定量分析。薄 层色谱斑点中物质的含量包含于a及b两个参数中。
理想的空白薄层板(简称空白板)的单位薄层厚度的吸光系数K＝0。 事实上，一般空白板K≠0。为了消除此影响，通常在薄层扫描中都是 以空白板为基准，测定相对透光率及相对反射率来计算薄层色谱斑点的 吸光度。 (a)在透射法中薄层色谱斑点的吸光度：
上式中i及i0分别为透过斑点及空白板的透射光光强，I0为照射光光强。 T与T0分别为斑点及空白板的透射率。
应用时应注意： 曲线校直法是一种简便的薄层扫描定量校准方法，但比较粗 糙，且有时难于准确知道薄层板的SX值。为了降低定量误差， 应使标准品的色谱峰峰面积与待测品(供试品)的色谱峰面积尽量 接近为好。
2. 薄层吸收扫描法的扫描方式及条件的选择
薄层吸收扫描法的扫描条件，包括扫描方式、波长及测光方式 等。扫描方式分为直线式及锯齿式扫描。扫描波长的选择至关重要， 不仅关系检测灵敏度，而且关系干扰的排除等。测光方式分为透射式及