研究生的实验室基本素质和基本训练
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实验技巧 • 条理化 • 顺序性 • one by one • 并行 • 对照性记录 • 实验好习惯 实验记录表格化： 1、原始记录表 2、单项归纳表 3、汇总表 • 推荐使用 Excel 表（例 数≤1000）和SPSS表
1、原始记录表（流水账）
No\指标 Name 1 2 3 4 5 6 7 Sex Age Height Weight BMI BP ……
补漏：
• • • • • 增加对照组数目和例数 例数不够统计学要求 重复出现系统误差的实验 补充对照 反复核实反对前人论点的 主要证据 • 设计新的反证 • 扩充和深化课题
阴性结果表明了什么?
• 真阴性(true negative)，即实验药物没有疗效； • 假阴性(type II error 或 beta)，即实验药物有疗效，但 检测不出来，或者说Power不够大。Power与样本数大 小有关, 样本数增加,则Power增加； • 如何知道样本数是否足够? 可计算Power。 • 只有假阴性的情况，通过增加样本数，才会造成疗效结 果的差异呈现统计学显著性，即呈现本来就存在的阳性 结果。 • 对于真阴性, 无论样本多大，差异都不会转变。 • 设计良好的临床实验，实验开始前，就应计算好具体的 样本数，以满足于足够的Power(至少达到80%)。
为什么要考研?
或者说，你从事科学研究的主 要动机和最大动力是什么？
至少，上研究生能得到哪些收获？
没有标准答案！
• 高端人才必由之路：硕士、博士、博士后、副高、正高、 博导、院士…想在专业上成就 • 等于升一级职称，干嘛不 • 专业不喜欢，改变自己职业方向 • 当医生到处挨打，怕了，找地方躲躲看 • 毕业没想好干什么。又没拿什么证，只好考研（随大溜） • 研究生扩招，赶末班车 • 本科压根就找不到工作 • 找到工作，工资太低 • 躲开就业高峰 • 知识改变命运 • 想出国 • 就是对科研感兴趣 • 哼！虚伪……
科学精神的培养
（二）科研的基本训练
——研究生的实验室素养
本讲内容
声明：部分来自唐朝枢教授二十年之传授
• • • • • • • • • 研究方向的确定 如何学习及整理文献 如何撰写综述及研究论文 如何进行科研课题设计 选题和制定研究计划 研究对象、方法的选择 快速适应实验室并开展科研训练 总结和撰写论文、基金申请 ……
A组：肿瘤+传统切除
肿瘤
B组：肿瘤+切断不摘除 C组：肿瘤+假手术
血管抑素和内皮抑素
• 它们解释肿瘤自限性生长、远处转移癌的 快速生长——随着原发瘤的去除，新生血 管抑制因子的水平也相应降低。循环中缺 少了新生血管抑制因子，转移灶不再受到 限制，进而快速生长（原发瘤抑癌） 正常和荷Lewis肺癌小鼠眼角膜的微小室中 持续释放bFGF，正常小鼠新毛细血管开始 生长而荷Lewis肺癌小鼠的新生血管化被完 全抑制：证实原发瘤可以限制远端由bFGF 诱导的血管形成（手术的价值以及手术切 除合并抗血管治疗的必要性的探讨） 摘除原发灶后，小鼠分别被给予血管抑素 和安慰剂，与对照组相比，血管抑素治疗 组的转移灶无论在数量上还是体积上均明 显减少。对照组肿瘤新生血管旺盛，而治 疗组转移灶在镜下观察不到新生血管（观 察血管抑素是否能抑制转移灶的生长） 恩度(重组人血管内皮抑制素注射液)上市
• • • • • • • •
设计类型： 配对 成组 析因设计 正交设计 单因素 多因素 。。。
设计的分类和要素（续）
• • • • • • • • • 病例临床治疗总结 个案报道 量表评定 随机对照试验 系统综述 单因素设计与多因素设计 回顾性分析 前瞻性设计 …… 无论哪种： • 是否有严格界定的的研究 对象？ • 事先是否有样本估计？ • 是否有适合的测量指标？ • 是否使用了正确的统计学 方法？ • 是否充分随机化，入组、 分组、测定？ • 终点事件是否足够、合理 • 是否符合伦理学要求？
2.实验设计能力-核心是选题
“三定” • 定方向﹥10年 • 定领域：5~10年 • 定课题﹤2年 “四要点” • 目的明确 • 依据充分 • 设计合理 • 方法恰当
如何选题和进行科研设计？
“五性” • 先进性(advance) • 独创性(originality) • 实用性(practicality) • 可行性(feasibility) • 影响力(citation) 五要素“5 Re…”： • Real (reliable) • Repeatable • Record (complete) • Relationship (to others) • Respect (your patients and animals)
Judah Folkman教授
最重要的是原始创新 ——血管抑素和内皮抑素的发现
• • 1983年Folkman的两位博士后从大鼠肿瘤中分离出一种蛋白：碱性纤 维母细胞生长因子（bFGF）,其观点才得到证实。继bFGF之后， VEGF等因子相继被发现，逐渐确立了血管形成理论 从实验中偶然发生污染，Folkman实验室从酵母菌中分离出夫马菌素 （fumigillin），动物实验证实其可以使肿瘤缩小。从荷Lewis肺癌小 鼠的尿液中寻找新生血管抑制剂又导致了血管抑素和内皮抑素等原发 癌分泌的新生血管抑制剂的发现
结果无法重现怎么办？
• • 1. 2. 3. 4. 发表论文时，详写操作，试剂，目的是为保证别人重现 结果。因此，自己的实验在同一条件下进行。 我们在实验过程中，确实也发现某些实验数据较难重复。 原因： 试剂纯度不符合要求或使用了不同批次、厂商的试剂； 实验对象有变：动物品系不纯、细胞来源不明… 反应的操作存在误差：突出表现在称量、加样等环节； 为了保证实验数据的可重复性，我们必须遵循或者建立 一套标准的反应流程(Mannuals of Operation Protocols Standard, MOPS)或SOP(Standard Operation Protocol)
建立实验程序和做实验记（1）
实验程序的建立 • 目标→内容→方法 • 方法的选择
A 照搬现成方法 B 重新建立方法 C 改动已有方法
• 研究生通病：改MOP • 预实验的必要性
方法选择原则 • 针对性强 • 一对一解决问题 • 可重复性和准确性 • 简为上 • 不求全
建立实验程序和做实验记（2）
• “培养判断力”——似乎是正确答案
我们上研究生究竟要学什么？
研究生的实验室修养
1. 2. 3. 4. 5. 6. 基本科研训练 选题和科研设计 建立实验程序和做实验记录 分析结果得出结论 合作、表达交流 撰写综述和论著、申请基金
基本科研训练
“六能力”： 1. 文献处理能力 2. 实验设计能力 3. 实验操作能力 4. 写作能力 5. 合作交流能力 6. 申请基金能力 1.重塑知识结构： ①“三三之比” ②“敲门砖”和 “金钥匙” ③临床医师与科学 素养 ④择业有帮助 • 应该持续终生
总之，要上学！ 那么，学什么好呢？
• 科学方法远比科学发现重要——卡尔· 萨根
• 科学与伪科学之间最显著的区别或许在于，科学比伪科 学更强烈地认识到人的不完善性和不可靠性
• 倘使我们只讲授科学的发现和成果，就算这些 发现和成果十分有用甚至激动人心，而不传授 批判性的科学方法，怎么能指望普通人将科学 与伪科学加以区分？
血管抑素
Biblioteka Baidu
O’Reilly&Folkman, 1995 in Nat Med O’Reilly&Folkman, 1997 in Cell endostatin
内皮抑素
•
极富创新意识，且新意不断，从不同方面 思考问题，在许多领域灵感四逸。如唐氏 综合征患者发生癌症的几率远远小于正常 人群，这可能与21号染色体的第三个副本 有关 肿瘤新生血管生成理论认为，一旦阻断肿 瘤新生血管生成切断营养供给，肿瘤将停 止生长、萎缩直至死亡。该理论为“抗肿 瘤血管生成治疗”这一全新的癌症研究方 向奠定了基础，并据此理论开发出了诸如 阿瓦斯丁（Avastin, Genentech）等十几 种新药
Age Height Weight
X均值±S X2 P df
BMI BP TGFβmRNA TGFβ蛋白…
分析结果得出结论（1）
统计学与结果
• 从设计一开始就选择正确 的统计方法：如变量的选 择重点和首先要看的—— 变量是否为正态分布 • 透过表面看统计：是否真 有“差异”，即差异是否 有统计学意义上的显著性 • 人：多因素分析 • 动物和细胞模型：单因素 分析
如何面对结果？
• 与预计相符的结果 • 禁止舍弃部分数据使之与 设想相符 • 直观结果与统计结果 • 一旦结果与预计不符，我 们如何寻找原因？是操作 失误还是？
分析结果得出结论（2）
数据核实与误差分析
• 资料核实：是否匹配、 分层，分组是否合理 • 数据核实与误差分析： 区分偶然误差和系统误 差 • 方法评估 • 善于找出新发现或与文 献矛盾之处 • 不怀疑并充分重视新发 现
8
9 10 ……
2、单项归纳表（阶段小结/1~3个月）
No\指标 X均值 S标准差 Name Sex Age Height Weight BMI BP ……
N个数
组别
3、汇总表（下为论文中的“三线表”）
No\指标 组1 X均值 S标准差 X2卡方值 P值 df自由度 …… 组数 个数 Age Height Weight BMI BP …… 组2 X均值 S标准差 X2卡方值 P值 df自由度 ……
实验设计的核心是选题
选题的核心是什么？
创新性！ Originality
抗血管生成理论鼻祖Folkman的故事
•
•
• • • •
1953年毕业于俄亥俄州立大学，1957年 哈佛大学医学院，波士顿儿童医院小儿外 科主任 上世纪60年代早期在国家海军医学中心服 役期间，他的有关理论的雏形已经形成 O’Reilly&Folkman, 1994 in Cell angiostatin
设计的重要性
• 科研设计是科研的灵 魂 • 没有“设计”就没有 科研 • 严密的设计是取得有 价值结果的先决条件 • 内容包罗万象,是研究 无主题的反映 • 本研究要解决的问题？ • 逮着什么算什么！ • 缺乏严格的设计或无 设计，这类研究即使 有重要的发现也属偶 然
设计的要素、原则和分类
• 1. 2. 3. • 1. 2. 3. 4. 三要素： 对象 指标 结果 四原则： 随机 对照 重复 均衡
阳性结果又表明了什么?
• 真阳性，即实验药物确实有疗效； • 假阳性 (type I error或 alpha)。虽然允许假阳性的发生机 率一般预先设定为小于0.05，但是，当用于表达疗效的指 标为多项(multiple outcomes)或试验组为多组(multiple comparison groups)时，假如仍按原来设定作为判断每一 个统计比较是否则有意义时，会出现总假阳性机率增加 并超过0.05，或更高。 • 解决方法之一为缩小域值(如Bonferroni correction) • 临床试验报告中把增加的假阳性结果与其它作为阳性结 果一起报道的例子不少见，即使刊登在著名医学学术期 刊上的不少论文，作者似乎未曾考虑过或文中没有任何 关于控制假阳性的描述。
研究生通病：改MOP
• 为什么技术员老师次次都能做出来的实验我不能？ • 按照一套标准的实验方法进行操作，对于新手更为重要 • 事实上，很多文献的处理方法是不完善的，也在不断变 化的。所以才会有专门的丛书来总结。 • 有些文献的结果是很难重复的 • 有些操作是完全没有必要的 • 有些是错误的 • 也有可能作者故意有所保留。 • 提高我们的实验室素养，其中之一就在于判断文献的正 确与否，而不是盲从。
•
•
•
选题出发点
• • • • • 从临床来和回到临床去 短平快与长深久 找出本人和本单位优势 强强组合 力所能及
研究对象的选取
• • • • 人优于其它 差异和多样性 群体研究和个体研究 动物模型和细胞模型 的目的 • 动物模型和细胞模型 的选择 • 设定指标与实验分组 • 根据研究目的设定指 标：以少为佳 • 按照统计学要求分组 • 对照组的必要性 • 对照的选取 • 根据对象/对照选择 正确的统计方法
1、原始记录表（流水账）
No\指标 Name 1 2 3 4 5 6 7 Sex Age Height Weight BMI BP ……
补漏：
• • • • • 增加对照组数目和例数 例数不够统计学要求 重复出现系统误差的实验 补充对照 反复核实反对前人论点的 主要证据 • 设计新的反证 • 扩充和深化课题
阴性结果表明了什么?
• 真阴性(true negative)，即实验药物没有疗效； • 假阴性(type II error 或 beta)，即实验药物有疗效，但 检测不出来，或者说Power不够大。Power与样本数大 小有关, 样本数增加,则Power增加； • 如何知道样本数是否足够? 可计算Power。 • 只有假阴性的情况，通过增加样本数，才会造成疗效结 果的差异呈现统计学显著性，即呈现本来就存在的阳性 结果。 • 对于真阴性, 无论样本多大，差异都不会转变。 • 设计良好的临床实验，实验开始前，就应计算好具体的 样本数，以满足于足够的Power(至少达到80%)。
为什么要考研?
或者说，你从事科学研究的主 要动机和最大动力是什么？
至少，上研究生能得到哪些收获？
没有标准答案！
• 高端人才必由之路：硕士、博士、博士后、副高、正高、 博导、院士…想在专业上成就 • 等于升一级职称，干嘛不 • 专业不喜欢，改变自己职业方向 • 当医生到处挨打，怕了，找地方躲躲看 • 毕业没想好干什么。又没拿什么证，只好考研（随大溜） • 研究生扩招，赶末班车 • 本科压根就找不到工作 • 找到工作，工资太低 • 躲开就业高峰 • 知识改变命运 • 想出国 • 就是对科研感兴趣 • 哼！虚伪……
科学精神的培养
（二）科研的基本训练
——研究生的实验室素养
本讲内容
声明：部分来自唐朝枢教授二十年之传授
• • • • • • • • • 研究方向的确定 如何学习及整理文献 如何撰写综述及研究论文 如何进行科研课题设计 选题和制定研究计划 研究对象、方法的选择 快速适应实验室并开展科研训练 总结和撰写论文、基金申请 ……
A组：肿瘤+传统切除
肿瘤
B组：肿瘤+切断不摘除 C组：肿瘤+假手术
血管抑素和内皮抑素
• 它们解释肿瘤自限性生长、远处转移癌的 快速生长——随着原发瘤的去除，新生血 管抑制因子的水平也相应降低。循环中缺 少了新生血管抑制因子，转移灶不再受到 限制，进而快速生长（原发瘤抑癌） 正常和荷Lewis肺癌小鼠眼角膜的微小室中 持续释放bFGF，正常小鼠新毛细血管开始 生长而荷Lewis肺癌小鼠的新生血管化被完 全抑制：证实原发瘤可以限制远端由bFGF 诱导的血管形成（手术的价值以及手术切 除合并抗血管治疗的必要性的探讨） 摘除原发灶后，小鼠分别被给予血管抑素 和安慰剂，与对照组相比，血管抑素治疗 组的转移灶无论在数量上还是体积上均明 显减少。对照组肿瘤新生血管旺盛，而治 疗组转移灶在镜下观察不到新生血管（观 察血管抑素是否能抑制转移灶的生长） 恩度(重组人血管内皮抑制素注射液)上市
• • • • • • • •
设计类型： 配对 成组 析因设计 正交设计 单因素 多因素 。。。
设计的分类和要素（续）
• • • • • • • • • 病例临床治疗总结 个案报道 量表评定 随机对照试验 系统综述 单因素设计与多因素设计 回顾性分析 前瞻性设计 …… 无论哪种： • 是否有严格界定的的研究 对象？ • 事先是否有样本估计？ • 是否有适合的测量指标？ • 是否使用了正确的统计学 方法？ • 是否充分随机化，入组、 分组、测定？ • 终点事件是否足够、合理 • 是否符合伦理学要求？
2.实验设计能力-核心是选题
“三定” • 定方向﹥10年 • 定领域：5~10年 • 定课题﹤2年 “四要点” • 目的明确 • 依据充分 • 设计合理 • 方法恰当
如何选题和进行科研设计？
“五性” • 先进性(advance) • 独创性(originality) • 实用性(practicality) • 可行性(feasibility) • 影响力(citation) 五要素“5 Re…”： • Real (reliable) • Repeatable • Record (complete) • Relationship (to others) • Respect (your patients and animals)
Judah Folkman教授
最重要的是原始创新 ——血管抑素和内皮抑素的发现
• • 1983年Folkman的两位博士后从大鼠肿瘤中分离出一种蛋白：碱性纤 维母细胞生长因子（bFGF）,其观点才得到证实。继bFGF之后， VEGF等因子相继被发现，逐渐确立了血管形成理论 从实验中偶然发生污染，Folkman实验室从酵母菌中分离出夫马菌素 （fumigillin），动物实验证实其可以使肿瘤缩小。从荷Lewis肺癌小 鼠的尿液中寻找新生血管抑制剂又导致了血管抑素和内皮抑素等原发 癌分泌的新生血管抑制剂的发现
结果无法重现怎么办？
• • 1. 2. 3. 4. 发表论文时，详写操作，试剂，目的是为保证别人重现 结果。因此，自己的实验在同一条件下进行。 我们在实验过程中，确实也发现某些实验数据较难重复。 原因： 试剂纯度不符合要求或使用了不同批次、厂商的试剂； 实验对象有变：动物品系不纯、细胞来源不明… 反应的操作存在误差：突出表现在称量、加样等环节； 为了保证实验数据的可重复性，我们必须遵循或者建立 一套标准的反应流程(Mannuals of Operation Protocols Standard, MOPS)或SOP(Standard Operation Protocol)
建立实验程序和做实验记（1）
实验程序的建立 • 目标→内容→方法 • 方法的选择
A 照搬现成方法 B 重新建立方法 C 改动已有方法
• 研究生通病：改MOP • 预实验的必要性
方法选择原则 • 针对性强 • 一对一解决问题 • 可重复性和准确性 • 简为上 • 不求全
建立实验程序和做实验记（2）
• “培养判断力”——似乎是正确答案
我们上研究生究竟要学什么？
研究生的实验室修养
1. 2. 3. 4. 5. 6. 基本科研训练 选题和科研设计 建立实验程序和做实验记录 分析结果得出结论 合作、表达交流 撰写综述和论著、申请基金
基本科研训练
“六能力”： 1. 文献处理能力 2. 实验设计能力 3. 实验操作能力 4. 写作能力 5. 合作交流能力 6. 申请基金能力 1.重塑知识结构： ①“三三之比” ②“敲门砖”和 “金钥匙” ③临床医师与科学 素养 ④择业有帮助 • 应该持续终生
总之，要上学！ 那么，学什么好呢？
• 科学方法远比科学发现重要——卡尔· 萨根
• 科学与伪科学之间最显著的区别或许在于，科学比伪科 学更强烈地认识到人的不完善性和不可靠性
• 倘使我们只讲授科学的发现和成果，就算这些 发现和成果十分有用甚至激动人心，而不传授 批判性的科学方法，怎么能指望普通人将科学 与伪科学加以区分？
血管抑素
Biblioteka Baidu
O’Reilly&Folkman, 1995 in Nat Med O’Reilly&Folkman, 1997 in Cell endostatin
内皮抑素
•
极富创新意识，且新意不断，从不同方面 思考问题，在许多领域灵感四逸。如唐氏 综合征患者发生癌症的几率远远小于正常 人群，这可能与21号染色体的第三个副本 有关 肿瘤新生血管生成理论认为，一旦阻断肿 瘤新生血管生成切断营养供给，肿瘤将停 止生长、萎缩直至死亡。该理论为“抗肿 瘤血管生成治疗”这一全新的癌症研究方 向奠定了基础，并据此理论开发出了诸如 阿瓦斯丁（Avastin, Genentech）等十几 种新药
Age Height Weight
X均值±S X2 P df
BMI BP TGFβmRNA TGFβ蛋白…
分析结果得出结论（1）
统计学与结果
• 从设计一开始就选择正确 的统计方法：如变量的选 择重点和首先要看的—— 变量是否为正态分布 • 透过表面看统计：是否真 有“差异”，即差异是否 有统计学意义上的显著性 • 人：多因素分析 • 动物和细胞模型：单因素 分析
如何面对结果？
• 与预计相符的结果 • 禁止舍弃部分数据使之与 设想相符 • 直观结果与统计结果 • 一旦结果与预计不符，我 们如何寻找原因？是操作 失误还是？
分析结果得出结论（2）
数据核实与误差分析
• 资料核实：是否匹配、 分层，分组是否合理 • 数据核实与误差分析： 区分偶然误差和系统误 差 • 方法评估 • 善于找出新发现或与文 献矛盾之处 • 不怀疑并充分重视新发 现
8
9 10 ……
2、单项归纳表（阶段小结/1~3个月）
No\指标 X均值 S标准差 Name Sex Age Height Weight BMI BP ……
N个数
组别
3、汇总表（下为论文中的“三线表”）
No\指标 组1 X均值 S标准差 X2卡方值 P值 df自由度 …… 组数 个数 Age Height Weight BMI BP …… 组2 X均值 S标准差 X2卡方值 P值 df自由度 ……
实验设计的核心是选题
选题的核心是什么？
创新性！ Originality
抗血管生成理论鼻祖Folkman的故事
•
•
• • • •
1953年毕业于俄亥俄州立大学，1957年 哈佛大学医学院，波士顿儿童医院小儿外 科主任 上世纪60年代早期在国家海军医学中心服 役期间，他的有关理论的雏形已经形成 O’Reilly&Folkman, 1994 in Cell angiostatin
设计的重要性
• 科研设计是科研的灵 魂 • 没有“设计”就没有 科研 • 严密的设计是取得有 价值结果的先决条件 • 内容包罗万象,是研究 无主题的反映 • 本研究要解决的问题？ • 逮着什么算什么！ • 缺乏严格的设计或无 设计，这类研究即使 有重要的发现也属偶 然
设计的要素、原则和分类
• 1. 2. 3. • 1. 2. 3. 4. 三要素： 对象 指标 结果 四原则： 随机 对照 重复 均衡
阳性结果又表明了什么?
• 真阳性，即实验药物确实有疗效； • 假阳性 (type I error或 alpha)。虽然允许假阳性的发生机 率一般预先设定为小于0.05，但是，当用于表达疗效的指 标为多项(multiple outcomes)或试验组为多组(multiple comparison groups)时，假如仍按原来设定作为判断每一 个统计比较是否则有意义时，会出现总假阳性机率增加 并超过0.05，或更高。 • 解决方法之一为缩小域值(如Bonferroni correction) • 临床试验报告中把增加的假阳性结果与其它作为阳性结 果一起报道的例子不少见，即使刊登在著名医学学术期 刊上的不少论文，作者似乎未曾考虑过或文中没有任何 关于控制假阳性的描述。
研究生通病：改MOP
• 为什么技术员老师次次都能做出来的实验我不能？ • 按照一套标准的实验方法进行操作，对于新手更为重要 • 事实上，很多文献的处理方法是不完善的，也在不断变 化的。所以才会有专门的丛书来总结。 • 有些文献的结果是很难重复的 • 有些操作是完全没有必要的 • 有些是错误的 • 也有可能作者故意有所保留。 • 提高我们的实验室素养，其中之一就在于判断文献的正 确与否，而不是盲从。
•
•
•
选题出发点
• • • • • 从临床来和回到临床去 短平快与长深久 找出本人和本单位优势 强强组合 力所能及
研究对象的选取
• • • • 人优于其它 差异和多样性 群体研究和个体研究 动物模型和细胞模型 的目的 • 动物模型和细胞模型 的选择 • 设定指标与实验分组 • 根据研究目的设定指 标：以少为佳 • 按照统计学要求分组 • 对照组的必要性 • 对照的选取 • 根据对象/对照选择 正确的统计方法