医院检验中心酯酶染色中性非特异性脂酶染色操作规程

医院检验中心酯酶染色---中性非特异性脂酶(α—NAE)染色操作规程

[方法学]

酯酶染色的方法很多，根据与pH底物等不同作用，将常用的酯酶染色法分为两大类，即特异性酯酶染色和非特异性酯酶染色。后者又可分为3类：①中性非特异性酯酶染色法：α—乙酸菜酚酯酶、乙酸菜酚酯酶和乙酸菜酚AS-D酯酶。②酸性非特异性酯酶染色法：α—乙酸菜酯酶和α—丁酸菜酯酶。②碱性非特异性酯酶染色法：α—丁酸菜酯酶。中性非特异性酯酶染色是单核细胞与粒细胞白血病区别的重要方法，一般实验室可选用此法。

[原理]

α—乙酸萘酚经酯酶水解产生萘酚，萘酚与重氮盐偶联，生成灰黑或棕黑色沉淀物，定位于胞浆中。

[试剂]

1．α—醋酸萘酯丙酮液：α—醋酸萘酯1g，加丙酮和蒸馏水混合液100m1，溶解后贮于磨口带塞三角瓶内，4℃

保存，可使用半年。

2.pH7．4磷酸盐缓冲液：0．07MNa2HPO4(即Na2HPO4)

3．基质液：磷酸盐缓冲液82ml，缓慢滴加α-醋酸萘酯丙酮液1．6ml(滴速约每分钟40滴)，边加边用力振摇。

根据5分钟后，加坚牢蓝B80mg，剧烈振摇10分钟，

立即过滤，滤液两杯，各40ml。

4．氟化钠基质液：称取氟化钠(NaF)61mg加入上述其中基质液1杯内，混匀后，标上标记。

[操作]

(1)新鲜涂片两张，分别标上NSE和NaF记号，滴加10％

甲醛生理盐水，固定5分钟，用自来水轻轻冲洗，当

心血膜脱落，晾干。

(2)两张涂片同时放入各自染色杯内，37℃水浴1小时。

(3)取出后水洗，晾干后镜检。不用复染。

[结果观察]

在胞浆内若有棕黑色或灰黑色弥漫性颗粒沉淀者为阳性，细胞脑浆为黄色者为阴性。

[临床意义]

1．阳性：单核细胞和组织细胞呈强阳性，但可被氟化钠抑制；巨核细胞及血小板呈阳性；早幼粒细胞白血

病时早幼粒细胞可阳性，且不受氟化钠抑制。

2．弱阳性及阴性：粒细胞、淋巴细胞一般为阴性，若有弱阳性也可被氟化钠抑制。

3．临床鉴别：主要用于鉴别急性单核细胞性白血病与急性粒细胞性白血病，前者NSE阳性，且受氟化钠

(NaF)抑制；而后者NSE阴性，若有阳性也不受氟

化钠抑制。

[附注]

(1)坚牢蓝B和氟化钠可小包分装后干燥器保存

(2)基质液配制过程中要振摇，以促使基质溶解。冬天配

制时应适当加温(置于37℃水箱操作)。基质液现配现

用，不能保存，过滤后应尽快试验，以免大量沉淀物析出，影响染色效果。

D10、铁染色

[原理]

骨髓细胞外铁和有核红细胞中的铁粒，在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，呈阳性普鲁士蓝反应。

[试剂]

(1)200g/L亚铁氰化钾溶液，溶液可保存数周，明显发绿

和较多沉渣时应重配。

(2)浓盐酸，可取少量贮存于油瓶内备用。放置时间太长

或用时未见冒烟现象，应即更换。

(3)铁染色应用液，即加浓盐酸约20滴于干净的10mL离

心管(或小量杯)中，再加200g儿亚铁氰化钾溶液少量，混合液变泥浊，然后缓慢再滴加双铁氰化钾溶液’，

使混浊消失即可。此液不必过滤，也不用离心。但应

现配现用，不能保存.

[操作]

(1)取骨髓小粒较多的涂片1张，用铅笔写上姓名、时间。

最好用蜡笔在涂片体、尾部划两条线，以防做细胞内

铁染料复染时液体渗出。

(2)使应用液盖满涂片，于室温作用30分钟，冬天可适当

延长，后以自来水轻轻冲洗，以免髓膜脱落。

(3)待干后，在蜡笔线中间区加0．5％伊红乙醇溶液复染

2分钟。水洗，待干。

(4)在骨髓小粒内观察细跑外铁，在伊红复染区镜检红细

胞内铁。

[结果观察]

1．细胞外铁：常用低倍镜观察

(-)：骨髓小粒呈黄色，无蓝龟成分。

(+)：小粒网架中分布较淡的蓝色成分。

(++)：有较多蓝色铁粒和深蓝色的圆形小珠。

(+++)：肉．眼可观察到小粒变为蓝色;镜下有许多铁

粒、小珠和少数蓝色小块。

(++++)：肉眼可观察到小粒明显变蓝色。有大量的铁

粒、小珠和许多蓝色小块。

2．细胞内铁：

计数100个有核红细胞，记录阳性细胞(胞浆中有蓝色颗粒)的百分率。同时注意细胞内铁颗粒数目、大小、染色深浅，特别应注意有无环状铁粒幼红细胞。

[参考值]

细胞内铁：各人变化较大，一般在O．10—0．80(10—80％)。

换算系数：=％×0.01

细胞外铁：(+)一(++)

[临床意义]

(1)缺铁性贫血的外铁阴性：内铁平均6％，其铁粒细小，

数目4—2个。此类贫血约占总贫血病人的80％以上。

(2)铁粒幼细胞性贫血，环形铁粒(环核排列的粗大铁粒5

个以上或铁粒排列在核周1／3以上)的幼红细胞占总

有核红细胞的15％以上。

(3)其他贫血的铁染色情况不一，如巨幼细胞性贫血可伴

有缺铁。也可以出现正常或增多。

[附注]

(1)铁染色用的玻片、杯子、试剂等应避免受铁剂污染。

玻片事先应作好除铁处理，不能放有铁锈的烤箱内烘

烤。

(2)亚铁氰化钾消除混浊时，因反应较慢，后期滴加速度

不宜太快。

(3)反应时间不宜太长，否则析出的结晶会沉积在涂片上，

较难冲洗之。

(4)伊红易结晶析出，故复染时间太长或浓度太高，均会

影响细胞内铁的观察。

(5)铁染色作为一种最简便的常规组化，有助于各种贫血的诊断和鉴别诊断，当涂片无骨髓小粒，虽无法观察外铁，但内铁的观察对贫血的诊断也可起决定性的作用。